B7-H4在大鼠創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)腔中的表達(dá)情況

茍亞軍，蒲友敏，郭國(guó)寧

第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院急救部，重慶 400038

創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎（Post-tramatic Ostocarthritis）是骨關(guān)節(jié)炎的常見類型之一[1]。近年來，隨著外傷、交通事故的增多，創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率有增加的趨勢(shì)。至今，人們對(duì)軟骨損傷后的自然演變過程還不夠十分了解，創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚[2]。

近幾年的研究表明關(guān)節(jié)軟骨不僅能夠誘導(dǎo)潛在的自身免疫反應(yīng)，還可使自身免疫反應(yīng)持續(xù)發(fā)揮作用。有文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]，關(guān)節(jié)損傷后免疫系統(tǒng)及骨骼系統(tǒng)相互作用，導(dǎo)致創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。

T細(xì)胞的有效活化和效應(yīng)的發(fā)揮需要共刺激信號(hào)，B7-H4是共刺激因子B7家族的新成員，它可以通過抑制T細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)行以及細(xì)胞因子分泌發(fā)揮其負(fù)調(diào)控作用[5]，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示B7-H4還可作為嗜中性粒細(xì)胞免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在天然免疫過程中發(fā)揮重要作用[6]。

通過前期的研究，我們已經(jīng)構(gòu)建、表達(dá)并純化了小鼠B7-H4-Fc融合蛋白，建立了以牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型（CIA模型），并在體外證實(shí)B7-H4參與T細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)節(jié)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)B7-H4-Fc融合蛋白對(duì)CIA小鼠有一定的治療作用。目前筆者開始關(guān)注B7-H4在創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎中的作用及應(yīng)用的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性成年SD大鼠52只（第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重200~300 g。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組兩組，每組26只。

1.2 主要試劑及儀器

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國(guó)R&D公司），磷酸緩沖液（PBS）（第三軍醫(yī)大學(xué)免疫教研室提供）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 模型的建立 兩組大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉成功后，實(shí)驗(yàn)組用切斷右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶和切除部分內(nèi)側(cè)半月板的方式建立大鼠創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎模型[7-8]，在無菌條件下行右膝內(nèi)側(cè)髕骨旁切口，長(zhǎng)約2 cm，依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜、切斷外側(cè)副韌帶，打開關(guān)節(jié)囊，直視下探查關(guān)節(jié)腔無原發(fā)病變后，用眼科剪完整切除內(nèi)側(cè)半月板，用生理鹽水、慶大霉素沖洗關(guān)節(jié)腔，1號(hào)絲線逐層縫合，無菌包扎；對(duì)照組依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜、關(guān)節(jié)囊，用生理鹽水、慶大霉素沖洗關(guān)節(jié)腔，1號(hào)絲線逐層縫合，無菌包扎。

1.3.2 標(biāo)本采集 術(shù)后24 h、48 h，1、2、4周5個(gè)時(shí)間點(diǎn)， 行麻醉后在髕上囊部位關(guān)節(jié)腔注入1 ml無菌PBS灌洗，反復(fù)活動(dòng)關(guān)節(jié)后，仔細(xì)抽取灌洗液，做好標(biāo)記后立即置于-70℃冰箱中保存?zhèn)洳椤?/p>

1.3.3 B7-H4檢測(cè) 采用ELISA方法進(jìn)行標(biāo)本含量檢驗(yàn)。所有標(biāo)本采集后，實(shí)驗(yàn)前30 min配制好ELISA試劑（按照說明書），分別取每份關(guān)節(jié)腔灌洗液進(jìn)行B7-H4含量檢測(cè)。步驟按照ELISA試劑說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 12.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均值間差異比較采用t檢驗(yàn)，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理

實(shí)驗(yàn)過程中死亡12只，其中實(shí)驗(yàn)組死亡8只，對(duì)照組死亡4只。最后剔除5只體重過輕的大鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其中實(shí)驗(yàn)組2只，對(duì)照組3只，進(jìn)入統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組16只，對(duì)照組19只。

2.2 B7-H4的表達(dá)

由表1可見，對(duì)照組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)B7-H4含量表達(dá)均較低，且各時(shí)間點(diǎn)B7-H4含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)B7-H4含量均高于對(duì)照組（均P<0.05）。從表2及表3我們得出結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后48 h膝關(guān)節(jié)液中B7-H4含量較其他時(shí)間點(diǎn)明顯增高（P<0.05），術(shù)后2周B7-H4表達(dá)較術(shù)后 48 h 明顯降低（P<0.05）；術(shù)后 48 h，2、4 周 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的B7-H4表達(dá)呈降低趨勢(shì)。

3 討論

創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎主要是負(fù)重關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后的一種后遺癥，是繼發(fā)于關(guān)節(jié)創(chuàng)傷的骨關(guān)節(jié)炎，受傷后發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)短不一，臨床主要表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)的疼痛、不同程度的關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙，嚴(yán)重者有畸形改變，甚至致殘。創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生由多種原因造成，它曾經(jīng)被認(rèn)為是非炎癥性疾病，然而近期的很多研究支持炎癥是創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的病理變化過程中的重要環(huán)節(jié)[9]。Scanzello等[10]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞炎性因子廣泛參與創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的免疫發(fā)病機(jī)制，在創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。

表1 B7-H4在各組中的表達(dá)（ ±s）

表1 B7-H4在各組中的表達(dá)（ ±s）

P值24 h 48 h 1周2周4周各時(shí)間點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)組0.137±0.014 0.437±0.028 0.287±0.093 0.192±0.032 0.102±0.010對(duì)照組0.020±0.008 0.017±0.006 0.009±0.007 0.023±0.004 0.037±0.007<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

表2 實(shí)驗(yàn)組中B7-H4在48 h點(diǎn)表達(dá)與其他各點(diǎn)的比較（ ±s）

表2 實(shí)驗(yàn)組中B7-H4在48 h點(diǎn)表達(dá)與其他各點(diǎn)的比較（ ±s）

注：與 48 h 比較，*P＜0.05

B7-H4實(shí)驗(yàn)組 其他時(shí)間點(diǎn)24 h 48 h 1周2周4周B7-H4含量0.137±0.014*0.437±0.028 0.287±0.093*0.192±0.032*0.102±0.010*

表3 實(shí)驗(yàn)組中B7-H4在48 h、2周、4周三點(diǎn)表達(dá)的漸變比較

Donohue最早提出，在胚胎和個(gè)體發(fā)育的過程中，軟骨組織大多處在和其機(jī)體自身免疫監(jiān)視系統(tǒng)相隔絕的狀態(tài)，然而當(dāng)軟骨受到某種損傷時(shí)，軟骨中的組織成分便可暴露出來，即可誘發(fā)針對(duì)自身軟骨成分的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗膠原抗體則可抑制軟骨細(xì)胞的DNA、膠原以及硫酸多糖的合成，從而進(jìn)一步加重軟骨的退變。Yuan等[11]認(rèn)為軟骨成分的暴露能夠誘導(dǎo)自體免疫性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，還會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子以及一些具有損傷機(jī)體作用的酶，產(chǎn)生的酶和細(xì)胞因子會(huì)破壞關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)，使部分軟骨抗原反復(fù)暴露于免疫系統(tǒng)中，這樣最終導(dǎo)致自體免疫反應(yīng)發(fā)生。

炎癥因子誘導(dǎo)多克隆B細(xì)胞分泌IgM、IgG、IgA，促使T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及其受體，對(duì)T淋巴細(xì)胞同時(shí)具有趨化與活化的2種作用，同時(shí)T淋巴細(xì)胞可以激活CD4、CD69、CD25、CD38、CD43、CD45 和組織相容性白細(xì)胞抗原（HLA）Ⅱ，產(chǎn)生免疫反應(yīng)，加重軟骨細(xì)胞的破壞[12]。

B7-H4（B7x,B7S1）是B7家族的新成員，其主要表達(dá)于活化的B細(xì)胞、樹突細(xì)胞（DCs），吞噬細(xì)胞及腎癌、乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌等腫瘤組織中[13-16]。早期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，B7-H4的一個(gè)可能受體為B細(xì)胞和T細(xì)胞衰減子（BTLA）8。最近實(shí)驗(yàn)表明除BTLA外，B7-H4還存在其他受體分子[17]。B7-H4與其受體交叉聯(lián)結(jié)后可抑制Th1細(xì)胞活化，下調(diào)IL-2、IFN等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。并可加劇實(shí)驗(yàn)變應(yīng)性腦脊髓炎（EAE）的炎癥，表明B7-H4參與調(diào)節(jié)T-B細(xì)胞相互作用而下調(diào)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，并參與調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞的功能及維持外周耐受[13-14]。B7-H4-Fc融合蛋白體外證實(shí)其可抑制T細(xì)胞的活化[13]，而我們的前期研究中也提示B7-H4-Fc融合蛋白體內(nèi)干預(yù)可延緩內(nèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。

在此次實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)，B7-H4在創(chuàng)傷急性期的關(guān)節(jié)中表達(dá)增高，其在創(chuàng)傷愈合后期表達(dá)逐漸降低，提示B7-H4表達(dá)的減弱與創(chuàng)傷后期創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。由此我們可以大膽的推測(cè)在創(chuàng)傷后期，關(guān)節(jié)腔中B7-H4表達(dá)減低，對(duì)T細(xì)胞及B細(xì)胞活化的負(fù)性調(diào)節(jié)減弱，導(dǎo)致T-B細(xì)胞大量活化，同時(shí)產(chǎn)生大量炎癥因子，體液免疫及細(xì)胞免疫的激進(jìn)推動(dòng)了創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。在下一步的實(shí)驗(yàn)中，我們重點(diǎn)要了解B7-H4在創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎中分別在關(guān)節(jié)軟骨及滑膜中的表達(dá)情況，并同時(shí)與IL-2、IFN對(duì)比，了解其相關(guān)性。筆者認(rèn)為B7-H4有望成為診斷及治療創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵。

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