依達拉奉對沙鼠前額葉切除后學習與記憶的影響

王貴振 范衛慶 曹剛仁 湯永洋 王 亮 史 強

山東新泰市人民醫院神經外科 新泰 271200

依達拉奉對沙鼠前額葉切除后學習與記憶的影響

王貴振 范衛慶 曹剛仁 湯永洋 王 亮 史 強

山東新泰市人民醫院神經外科 新泰 271200

目的探討依達拉奉對沙鼠前額葉切除后學習記憶的影響及其機制。方法40只蒙古沙土鼠隨機分為4組,假手術組、前額葉切除組、對照組、依達拉奉治療組,每組10只。7 d后應用4-PTT(4-pellet taking test)旱路迷宮對各組沙鼠學習記憶功能進行評定。完成迷宮實驗的沙鼠取腦組織行HE染色和膽堿能神經元免疫組化染色,觀察海馬CA1區神經元損傷程度,用錐體細胞密度評價,CHAT陽性膽堿能神經元細胞用真彩色圖像分析系統定量和半定量分析。結果4-PTT旱路迷宮實驗顯示,前額葉切除組中沙鼠參照記憶指標和工作記憶指標與假手術組有明顯的差異(P＜0.05),依達拉奉治療組上述指標顯著改善(P＜0.05)。假手術組未見壞死神經元,前額葉皮質切除組每個高倍視野中錐體細胞數和陽性膽堿能神經元數均少于假手術組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。依達拉奉治療組每個高倍視野中錐體細胞數和陽性膽堿能神經元數均多于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。結論依達拉奉能改善前額葉切除沙鼠的學習記憶能力,與其對膽堿能神經元的保護有關。

前額葉;膽堿能神經元;4-PTT旱路迷宮;依達拉奉

依達拉奉可清除自由基,抑制脂質過氧化,從而抑制腦細胞、血管內皮細胞、神經細胞的氧化損傷,在治療缺血性腦血管病方面有一定療效。但依達拉奉對腦損傷后引發的高級功能障礙是否具有改善作用尚需深入研究。本研究利用沙鼠的前額葉切除模型,用4-PTT(4-pellet taking test)旱路迷宮及組織學方法,從海馬區神經元和膽堿能細胞的變化角度,來探討依達拉奉對學習記憶的影響。

1 材料和方法

1.1 動物模型制備 參考文獻[1]報道的方法制作前額葉皮質切除模型。在(22±1)℃環境溫度下,將沙鼠予3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于立體定向儀上。切開頭皮,暴露顱骨,在冠狀縫前 1.0 mm、矢狀縫旁開2 mm處用顯微磨鉆鉆一小骨窗,用顯微持針器擴大骨窗。用自制吸引器吸除冠狀縫前約1.0 mm至額極的右側額葉背外側皮質,作一 4 mm×3 mm×1mm大小的創腔,明膠海綿填塞止血后縫合頭皮。各組動物在手術完成7 d或21 d后進行4-PTT旱路迷宮實驗,測試學習記憶能力。

1.2 分組及給藥方法 40只雄性蒙古沙土鼠(浙江省實驗動物中心),體質量60～80 g,9～12周齡,隨機分為：假手術組,前額葉切除組,對照組(與依達拉奉等量0.9%氯化鈉溶液),依達拉奉治療組,每組10只。依達拉奉組于腦缺血后即刻尾靜脈注射依達拉奉0.5 mg/kg,1次/d,連續 7 d。對照組注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.3 腦組織形態結構觀察 迷宮實驗完成后動物取前囟后2.5～4.0mm之間的大腦部分進行常規脫水,石蠟包埋,切片行HE染色。海馬神經元損傷的評價主要依據Kirino[2]等人的方法,在Olympus光鏡下觀察海馬CA 1區錐體層細胞形態變化并計數單位高倍視野(400×)下的神經元數,即神經元密度(Neuronal density,ND)。我們在左右兩側海馬各任取3個高倍視野(400×)記數,取平均值。

1.4 膽堿能神經元觀察 石蠟切片,常規脫蠟至水。按試劑盒說明行CHA T免疫組化染色。在顯微鏡下計數兩側海馬CA1區各3個高倍視野(400×)范圍內的 CHA T陽性細胞并取平均值。

1.5 4-PTT旱路迷宮實驗,測試沙鼠學習記憶能力 主要采用的檢測指標為：(1)達到完成標準所需的實驗次數;(2)每次完成實驗所用的時間;(3)每次實驗中從開始到吃掉第一個食丸所用的時間;(4)每次實驗中的正確錯誤數。指標(1)、(2)、(3)主要觀察動物通過訓練后能正確完成實驗的情況,反映動物參照記憶的形成,指標(4)主要觀察動物進入無食物盒次數、重復進入已吃掉食物食盒次數,反映動物工作記憶的形成。

1.6 統計學處理 實驗結果用均數±標準差表示,用SAS 8.20版統計軟件包進行完全隨機設計的方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 學習記憶測試結果 與假手術組比較,前額葉切除組中沙鼠TCTP、TCFP、TRCS、IE和 CE都有明顯差異(P＜0.05);與前額葉切除組比較,對照組中上述指標無明顯變化,而依達拉奉治療組有較大的改善,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 病理結果(HE染色)假手術組 海馬CA 1區神經元結構完整,排列整齊致密,未見變性壞死的神經元;缺血組與對照組海馬CAI區神經元大部分變性壞死,細胞間隙加大,細胞核濃縮、深染,溶解、消失;依達拉奉治療組海馬CA1區存活的神經元較前額葉切除組明顯增多,大部分為結構完整的神經元;4組神經元密度差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.3 CHAT免疫組織化學結果 顯微鏡觀察發現假手術組沙鼠海馬CA1區陽性膽堿能神經元結構完整,排列整齊致密,可見2～3層細胞,細胞核染色淡,核仁清晰,胞漿染成深棕色,未見明顯變性壞死的神經元。前額葉切除組可見海馬CA 1區陽性膽堿能神經元排列稀疏,胞漿染成淺棕色,可見變性壞死的神經元。見表2。

表1 各組工作記憶與參照記憶的比較

表2 各組海馬CA 1區神經元密度與陽性膽堿能神經元的比較

3 討論

本實驗中,應用4-P1T旱路迷宮測試系統,全面、客觀的對實驗動物的空間認知、記憶加工過程進行評價,結果顯示：前額葉切除后沙鼠的學習記憶能力明顯受損,依達拉奉治療組沙鼠參照記憶和工作記憶明顯改善。依達拉奉通過多個途徑減少自由基的產生,減輕自由基對組成細胞磷脂膜的多聚不飽和脂肪酸的氧化損傷,抑制出血后神經細胞凋亡和細胞(血管內皮細胞、神經細胞)的過氧化作用,從而減輕腦水腫和腦組織損傷[3-4]。因膽堿能神經元釋放的乙酰膽堿在學習與記憶中有重要的調節作用,保持其功能正常,是維持哺乳動物學習記憶正常進行的必要條件[5]。

[1]吳佐泉,王溶楊,馬廉亭,等.胎腦組織移植對額葉皮層損傷大鼠辨別學習、記憶之影響[J].中華器官移植雜志,1997,18(1)：42-44.

[2]Kirino T,Tamu ra A,Sano K.A reversible ty pe of neu ronal injury follow ing ischem ia in the gerbil hippocam pus[J].Stroke,1986,17：455

[3]Kozue S,Yuki OL Semi S,et al.Edaravone scavengers nitric oxide[J].Redox Report,2002,7(4)：219-222.

[4]陳吉相,季艷梅,孫圣剛,等.依達拉奉對腦出血大鼠細胞凋亡及Bc l-2、Bax蛋白表達的影響[J].華中科技大學學報(醫學版),2007,36(2)：259-261.

[5]萬選才,楊天祝,徐承燾.現代神經生物學[M].北京：北京醫科大學/中國協和醫科大學聯合出版社,1999：127.

Effect of Edaravone on learning-mem ory after prefrontal cortex excision in gerbils

Wang Guizhen,Fan Weiqing,Cao Gangren,etal.Departmentof Neurosurgery,X intaiPeop le's Hospital,X intai271200,China

ObjectiveTo investigate the effect and the possib le p rotectivemechanism of Edaravone on learning-memory function after p refrontal cortex(PFC)excision in gerbils.MethodsForty gerbils w ere random ly divided into sham-operated group,prefrontal cortex excision group,controlgroup,and Edaravone treatment group.The gerbils of allgroupsw ere carried out 4-PTT maze experiment on the seventh day after operating.After themaze experiment,the brain tissue of the gerbilsw as performed HE staining and immunohistochemical staining of CHAT-positive cholinergic neuron.The damaging degreeofnerve cells in hippocam pus CA1 region w as evaluated by neuronal density.CHAT-positive cho linergic neuron were detected by color image analysis system.Resu lts There were significant differences in the indexes of reference-memory and workingmemory betw een sham operation group and prefrontal cortex excision group.The indexes in Edaravone treatmentgroup w ere improved obviously(P＜0.05);No degenerated and necrotic neurons were found in sham operation group.The density of neurons in p refrontal cortex excision group w as significantly decreased,as compared with that in sham group(P＜0.05).The density of neurons in Edaravone was obviously increased,as compared with that in prefrontal cortex excision group(P＜0.05).The ND/HS,CHAT-positive cells/HS of PFC group w ere fewer than those of sham-operated group,and had statistical significance(P＜0.05);The ND/HS,CHAT-positive cells/HS of Edaravone treatment group weremore than those of controlgroup,and had statistical significance(P＜0.05).ConclusionEdaravone can imp rove the learning-memory function after prefrontal cortex excision in gerbils,because of its protection on cholinergic neurons.

PFC;Cholinergic neuron;4-pellet taking test;Edaravone

R-332

A

1673-5110(2011)07-0014-03

(收稿2011-01-18)