MMP-2、MMP-9基因多態性與缺血性腦卒中臨床分型及預后

劉 丹 王亞春 孫洪英 連 瑜 賈 璐 吳麗娥 王貴喜 郭 霞

包頭醫學院第一附屬醫院神經內2科 包頭 014010

MMP-2、MMP-9基因多態性與缺血性腦卒中臨床分型及預后

劉 丹 王亞春 孫洪英 連 瑜 賈 璐 吳麗娥 王貴喜 郭 霞

包頭醫學院第一附屬醫院神經內2科 包頭 014010

目的探討基質金屬蛋白酶2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)基因 C1306T、C735T和MM P-9基因C1562T多態性位點與缺血性腦卒中的關系。方法采用限制性片段長度多態性分析技術,檢測缺血性腦卒中組232例和健康對照組235例MMP-2基因C1306T、C735T和MMP-9基因C1562T多態的分布。結果缺血性腦卒中組和對照組MMP-2 C1306T基因型和等位基因頻率分布無統計學意義。在動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死組MM P-9 C1562T的CT+TT基因型頻率和T等位基因頻率、MMP-2 C735T的CC基因型頻率和C等位基因頻率明顯高于對照組(P＜0.05),而在腦栓塞組、腔梗組差異無統計學意義(P＞0.05)。多因素Logistic回歸分析,MM P-2、MMP-9不同基因型別與缺血性腦卒中預后無顯著相關性(P＞0.05)。結論MMP-2 C735T的C等位基因、MM P-9 C1562T的T等位基因是動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死的遺傳易感基因之一。MMP-2、MMP-9基因多態性與缺血性腦卒中預后無關。

基質金屬蛋白酶-2、9基因多態性;缺血性腦卒中;臨床分型;預后

MMP-2基因啟動子區1306、735和 MMP-9基因啟動子區1562位點存在C→T突變,從而影響 MMP-2、MMP-9的表達,影響腦卒中的發生發展。本文擬探討 MMP-2、M MP-9基因多態性與缺血性腦卒中的關系。

1 資料與方法

1.1 對象和方法 選擇2009-07～2010-10在我科連續住院的初發缺血性腦卒中患者,均符合全國第四屆腦血管病學術會議通過的診斷標準,并經頭顱CT或M RI檢查證實。缺血性腦卒中臨床分型包括動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死、腦栓塞、腔隙性腦梗死。有嚴重感染、惡性腫瘤、結締組織病以及1 a內患組織損傷疾病如心肌梗死、重大外科手術及接受免疫抑制劑治療者除外。同期選擇健康人群作為對照組。入組者均為包頭市長住居民,均為漢族,彼此無親緣關系。

1.2 基因型判定

1.2.1 標本采集及DNA的抽提：抽取患者晨空腹靜脈血2 m L,置EDTA-Na2抗凝管中-20℃冰箱保存備用。使用北京天根公司血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(PCR)：PCR引物序列參照文獻設計,由上海生工合成。MMP-2 C1306T序列為：上游引物5′-CTTCCTAGGCTGGTCCTTACTGA-3′下 游 引 物 5′-CTGAGACCTG AAGACCTAAAGAGCT-3′, 擴 增 產 物 為193bp。MM P-2 C735T序列為：上游引物5′-GGAT TCTTGGCTTGGCGCAGGA-3′下游引物 5′-GGGGGCTGGGTAAAATGAGGCTG-3′,擴增產物為 391 bp;MM P-9 C1562 T序列為：上游引物 5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′下游引物 5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3′,擴增產物 為435 bp。反應體系為 25μL,其中模板 DNA 100 ng,10×buffer 5μL,dDNPs 1μL,TaqDNA聚合酶 1.0 U和上下游引物各2μL;反應條為：94℃預變性5 min,然后94℃30 s,58 ℃(MMP-2 C1306T)、62 ℃(MMP-2 C735T)、或 65 ℃(MMP-9 C1562T)45 s,72℃45 s,30個循環后,72℃延伸10 m in。3種 PCR產物分別經 XspⅠ(MMP-2 C1306T)、HinfⅠ(MMP-2 C735T)和 PaeⅠ(MMP-9 C1562T)限制性內切酶酶切后分析基因型。結果見圖1、2、3。

圖1 PCR-XSPⅠ酶切的MMP-2 C1306T SNP基因型分型

圖2 PCR-HinfⅠ酶切的MMP-2 C735T SNP基因型分型

圖3 PCR-PaeⅠ酶切的MMP-9 C1562T SNP基因型分型

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件處理。用基因計數法計算單個基因型和等位基因頻率。不同基因型和等位基因頻率比較采用卡方檢驗。不同基因型別的預后比較,采用logistic回歸分析,并對年齡、性別、既往病史、血脂、血糖、并發癥、治療等因素進行校正。

表1 缺血性腦卒中與對照組 MMP-2、MM P-9的基因型和等位基因頻率 [例(%)]

2 結果

2.1 腦卒中組和對照組的一般臨床資料 缺血性腦卒中組232例,男144例,女 88例;平均年齡(62.07±4.88)歲。對照組235例,男146例,女89例;平均年齡(60.86±9.92)歲。2組年齡、性別比較差異無統計學意義,有可比性。和對照組比較,腦卒中組吸煙者、合并頸動脈粥樣硬化、收縮壓、舒張壓甘油三酯水平增高人數較多,差異有統計學意義(P＜0.05),而體重指數、血糖、總膽固醇水平雖然增高,但差異無統計學意義。

2.2 MMP-2基因C1306T、C735T和 MMP-9基因 C1562T基因型頻數分布 表2結果顯示,2組人群MM P-2基因C1306T、C735T和MM P-9基因 C1562T多態性基因型分布均處于H ardy-Weinberg平衡(P＜0.05),具有群體代表性。MMP-2基因C1306T的基因型和等位基因頻率分布缺血性腦卒中各組(動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死組115例、腦栓塞組31例、腔隙性腦梗死組 86例)和對照組之間比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死組MMP-2基因 C735T的 CC基因型、C等位基因頻率和MMP-9基因C1562T的CT+TT基因型頻率和T等位基因頻率明顯高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 MMP-2、MMP-9不同基因型與預后的關系 在患者病后21 d及3個月進行隨訪。預后評價指標采用死亡和殘疾。殘疾采用Barthel Index(BI)評價,BI指數≤60分為依賴,BI＞60分為非依賴。缺血性腦卒中組發病21 d時死亡2例,殘疾34例,到發病3個月時共死亡3例,殘疾19例。死亡和依賴者為預后差。非依賴者為預后好。以預后為因變量,以年齡、性別、既往史、入院時病情嚴重程度、有無并發癥、治療和MMP-2基因 C1306T、C735T和MM P-9基因C1562T基因型為自變量,進行多因素Logistic回歸分析,結果表明各基因型別與缺血性腦卒中預后無顯著相關性(P＞0.05)。

3 討論

缺血性腦卒中是一個多基因遺傳疾病,目前為止,其確切發病機制及其病理生理過程仍不清楚。大量研究表明MMP-2、MM P-9通過降解細胞外間質(ECM),參與了動脈粥樣硬化斑塊的形成、遷移、破裂崩解;腦缺血后再灌注損傷、腦梗死后出血轉化;神經元的凋亡等[1-5]。而與腦卒中的發生發展密切相關。

MMP-2基因定位于人類染色體16q21,包含多個SNPs,其中位于基因啟動子區存在1306C→T和735C→T變異,體外實驗已證實,C等位基因轉錄活性顯著高于T等位基因[6-7]。本研究發現MMP-2基因C1306T的基因型和等位基因頻率分布腦卒中各組和對照組之間比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。而MMP-2基因C735T的CC基因型和C等位基因頻率在動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死組明顯高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05),提示MMP-2 C735T的C等位基因與缺血性腦卒中的發病有關。我們推測,由于MMP-2 C735T的C等位基因頻率明顯高于對照組,導致基因轉錄水平增高,引起梗死區MMP-2表達增多,MMP-2降解 ECM,血腦屏障被破壞,進一步導致缺血性腦卒中患者血清MMP-2水平明顯增高,造成卒中后繼發性腦損傷。

MMP-9基因定位于人類染色體16q11.2-13.1,其中基因啟動子區存在1562C→T變異。當C突變為T后,最終表現為啟動子的活性增強,基因轉錄增強,蛋白質的表達量增加[8]。我們的研究發現MMP-9基因C1562T的CT+TT基因型頻率和T等位基因頻率在動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死組中明顯高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。我們推測,腦梗死組T等位基因增高,即C突變為T增多,導致基因轉錄增強,MM P-9表達明顯增加,促進動脈粥樣硬化斑塊的形成,增加斑塊的不穩定性,斑塊崩解、破裂,導致腦梗死的發生和梗死后繼發性腦損傷,因此MMP-9 C1562T的T等位基因與缺血性腦卒中的發病相關。我們進一步研究發現 MM P-2基因 C1306T、C735T和 MMP-9基因C1562T各基因型別與腦卒中預后,無顯著相關性(P＞0.05),國內未見相關報道。

綜上所述,MMP-2 C735T的 C等位基因、MMP-9 C1562T的T等位基因是缺血性腦卒中遺傳易感基因之一。然而,腦梗死發病機制復雜,是獲得性危險因素如生活方式、高血脂、高血壓、糖尿病等和種族、地域、環境、遺傳性危險因素如基因多態性等共同相互作用所致,本研究樣本含量較小,缺乏大規模、前瞻性特點,尚需擴大樣本深入研究,也將為防治缺血性腦卒中帶來新的方向。

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Study on polymorphisms ofmatrix metalloproteinase-2 and-9 genes,and clinical classification and prognosis of ischem ic stroke

Liu Dan,Wang Yachun,Sun Hongying,etal.Departmentof Neurology,the First A f filiated Hospita l,Baotou Medica l Col lege,Baotou014010,China

ObjectiveTo investigate theassociation betw een C1306T,C735T polymorphism ofmatrixmetalloproteinase-2 gene,C1562T polymorphism of matrix metalloproteinase-9 gene and ischem ic stroke.MethodsTwo hund red and thirty-two patientsw ith ischem ic stroke(115 cases of atherosclerotic thrombotic cerebral in farction,86 cases of lacunar infarc tion and 31 cases of cerebral embolism)and 235 healthy controlsw ere recruited.Polymerase chain reaction follow ed by restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to detect C1306T,C735T po lymorphism of MMP-2 gene and C1562T polymorphism of MMP-9 gene.ResultsThere wereno significant differences in genotype frequency of C1306T polymorphism of MMP-2 gene between ischemic stroke and controls.CT and TT genotype frequency of C1562T polymorphism of MMP-9 gene and T allele,CC genotype frequency of C735T polymorphism of MMP-2 gene and C allele in atherosclerotic thrombotic cerebral infarction w ere higher than controls;there wasn't significant difference between lacunar infarction,cerebralembolism and controls.There w ere no significant correlations betw een different genotype of MMP-2,MMP-9 and p rognosis of ischem ic stroke by Logistic regression analysis.ConclusionThese results suggest that the C allele of C735T of MMP-2 gene and T allele of C1562T ofMM P-9 gene are one of genetic susceptiblegenes to atherosclerotic th rombotic cerebral infarction.Polymorphisms of matrixmetalloproteinase-2,-9 genes have no correlation with p rognosis of ischemic stroke.

Polymorphisms ofmatrixmetallop roteinase-2 and-9 genes;Ischem ic stroke;Clinica lclassification;Prognosis

R743.33

A

1673-5110(2011)07-0003-03

(收稿2011-01-17)