陰離子交換樹脂對Streptomyces roseosporus發(fā)酵液中達托霉素的分離純化研究

王澤根，王文軼，吳 旻，吳勛貴，王偉明，王 旻

中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院，南京 210009

達托霉素 （Daptomycin）是從玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）發(fā)酵衍生得到[1]，是目前全球首個成功開發(fā)的環(huán)脂肽類抗生素[2]。由于其獨特的結(jié)構(gòu)和作用機制,在臨床上與萬古霉素相比表現(xiàn)出廣譜、藥效快、給藥量小、副反應(yīng)小等優(yōu)點,是目前世界上公認的萬古霉素等現(xiàn)用抗生素的最佳替代品[3]。此外，達托霉素對高致病耐藥菌如耐甲氧西林金葡菌（MRSA），糖肽類敏感的金葡菌（GISA）,耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）等均有高效低毒的殺菌效果，并且使用方便[4]。

目前，關(guān)于達托霉素粗提方法主要有國內(nèi)采用大孔吸附樹脂提取發(fā)酵液中達托霉素的報道[5]和國外專利介紹采用丁醇浸提或離子交換樹脂提取的方法[6]。本文對國產(chǎn)陰離子交換吸附劑進行篩選，旨在尋找一種分離效果好且價格相對低廉的陰離子交換樹脂，從Streptomyces roseosporus發(fā)酵液中提取達托霉素，并分別從靜態(tài)和動態(tài)吸附與洗脫兩方面考察了操作條件對達托霉素分離純化效果的影響，以期為達托霉素的進一步純化提供實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1200型高效液相色譜儀（包含雙泵、自動進樣器和DAD紫外檢測器，美國Agilent公司）；離子交換柱(20 cm×1.5 cm，上海華美實驗儀器有限公司)；Econo-pump橫流泵（美國Bio-RAD公司）。

達托霉素對照品Cubicin注射劑（含量900mg·g-1，美國Cubist公司）；乙腈為色譜純 （美國Merck公司）；其他試劑均為分析純。

弱堿性陰離子交換樹脂D301、強堿性陰離子交換樹脂717均購自安徽三星樹脂廠；弱堿性陰離子交換樹脂HZD-9、多孔型環(huán)氧系弱堿性陰離子交換樹脂335、弱堿性環(huán)氧系陰離子交換樹脂330、大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂D315均購自上海華震公司。

菌種與培養(yǎng)基見參考文獻[7]。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗方法[8]

發(fā)酵液預(yù)處理：按文獻[7]方法發(fā)酵結(jié)束后，將達托霉素發(fā)酵液以8000r·min-1離心30min，收集上清液。

靜態(tài)吸附與洗脫:分別量取6種樹脂5 mL，加入預(yù)先盛有100 mL達托霉素發(fā)酵液的250 mL三角瓶中，于200 r·min-1恒溫搖床中吸附，吸附完畢后用NaCl水溶液洗脫。

動態(tài)吸附：交換柱用樹脂裝填量30 mL，預(yù)處理后的離子交換樹脂裝柱。將預(yù)處理后的發(fā)酵液按實驗設(shè)計流速經(jīng)離子交換樹脂吸附，用5倍柱體積水沖洗后，按實驗設(shè)計的條件進行階段洗脫，每個階段洗脫體積為15倍柱體積（BV）。

2.2 測定方法[7]

達托霉素含量測定：HPLC法，色譜柱為HanBon C18柱 (4.6 mm×150 mm，3 μm)；流動相為乙腈 (含0.1%三氟乙酸)-0.1%三氟乙酸水溶液(41︰59)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為223 nm；柱溫為30℃；進樣量為20 μL。

2.3 離子交換樹脂的篩選

達托霉素發(fā)酵液中可溶性組分復(fù)雜，經(jīng)預(yù)處理后仍含有多肽、氨基酸、有機酸、無機鹽等雜質(zhì)。由于達托霉素為脂肽類物質(zhì)，在堿性條件下帶負電，宜用陰離子交換樹脂進行分離純化。因此選用6種不同類型的陰離子交換樹脂進行篩選，結(jié)果見表1。

表1 不同陰離子交換樹脂對達托霉素靜態(tài)吸附的比較

由表1可見，D315、HZD-9樹脂對發(fā)酵液中達托霉素的吸附量較低，不適用于對達托霉素的純化；D301、717、335和330對發(fā)酵液中達托霉素的吸附量都比較高。因此，本實驗對D301、717、335和330的洗脫率作進一步考察。

從圖1可見，盡管D301、717對達托霉素有較高的吸附量，但洗脫率很低，因此，這兩種樹脂也不適合于達托霉素的分離純化。330樹脂與335樹脂比較，雖然其對達托霉素的吸附量稍低，但其洗脫率最高，因此本研究選擇330樹脂做進一步研究。

2.4 330樹脂吸附條件的確定

圖1 4種樹脂對達托霉素的洗脫率

2.4.1 330樹脂對達托霉素靜態(tài)和動態(tài)吸附效果比較2.4.1.1 330樹脂的靜態(tài)吸附時間 將裝有330樹脂和發(fā)酵液的搖瓶放入恒溫搖床中，在30℃、200r·min-1、pH8.0～8.5的情況下?lián)u動，定時取樣測量。實驗結(jié)果如圖2所示，330樹脂對達托霉素的飽和吸附時間為10 h。

圖2 330樹脂對達托霉素的吸附時間

2.4.1.2 330樹脂的動態(tài)吸附效果 將發(fā)酵液(含達托霉素60.52 mg·L-1，pH8.0～8.5)分別以不同流速流過330樹脂床層，考察不同流速對達托霉素的動態(tài)吸附效果，結(jié)果見圖3。由圖3可見，隨著流速的降低，330樹脂對達托霉素的吸附效果越好。但是通過330樹脂對達托霉素吸附量的計算，發(fā)現(xiàn)從4BV·h-1～0.5 BV·h-1,330樹脂對達托霉素的吸附量都低于靜態(tài)吸附時樹脂對達托霉素的吸附量，且低流速動態(tài)吸附對達托霉素的飽和吸附時間遠多于靜態(tài)吸附，因此，動態(tài)吸附不適用于330樹脂對達托霉素的吸附。

圖3 330樹脂對達托霉素的動態(tài)吸附效果

2.4.2 發(fā)酵液pH對吸附效果影響 考察不同pH的發(fā)酵液對330樹脂吸附效果的影響（圖4），結(jié)果表明，發(fā)酵液的pH對330樹脂的吸附性能有明顯的影響，pH8.0～8.5時對達托霉素的吸附最有利。達托霉素為脂肽類物質(zhì)，一般為弱酸性物質(zhì)，在pH 8.0～9.0已充分解離，有利于與樹脂進行離子交換吸附。但在較高的pH環(huán)境下，達托霉素穩(wěn)定性較差，同時發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液pH值一般處在7.5～8.5之間，處于較佳吸附范圍內(nèi)，所以可以對發(fā)酵液進行直接吸附。

圖4 pH對330樹脂吸附量的影響

2.4.3 溫度對330樹脂吸附量的影響 考察不同環(huán)境溫度對330樹脂吸附效果的影響（圖5），結(jié)果表明，當溫度處于15℃～35℃時，對330樹脂的吸附效果只有輕微的影響，因此，可在常溫下進行330樹脂對達托霉素的吸附操作。

圖5 溫度對330樹脂吸附的影響

2.5 洗脫條件的確定

2.5.1 330樹脂洗脫時間 將裝有已飽和吸附達托霉素的330樹脂搖瓶放入恒溫搖床中，在30℃、200 r·min-1、0.8 mol·L-1NaCl的情況下?lián)u動，定時取樣測量。實驗結(jié)果如圖6所示，由此可見，達托霉素被330樹脂洗脫的時間為8 h，并且通過計算，其洗脫率達到最大洗脫率（92.5%），回收率達到了87.5%，并且純度由2%提高到60%。

圖6 達托霉素的靜態(tài)洗脫時間

2.5.2 洗脫劑NaCl濃度對洗脫率的影響 發(fā)酵液中的雜質(zhì)與樹脂之間吸附力與達托霉素存在明顯的差異，采取不同濃度的洗脫劑濃度對飽和吸附達托霉素的樹脂進行洗脫，達到達托霉素與雜質(zhì)分離的目的。采取靜態(tài)洗脫方式，考察不同濃度NaCl的洗脫效果，結(jié)果見圖7。可見，隨NaCl濃度增加，達托霉素的洗脫率升高，但洗脫液中NaCl濃度達到0.8 mol·L-1時，結(jié)合在330樹脂上的達托霉素基本上被洗脫下來。但當NaCl濃度繼續(xù)上升時，洗脫效率并沒有增加，反而出現(xiàn)小幅度的下降，并且與330樹脂結(jié)合更強的雜質(zhì)也同時被洗脫下來。因此，洗脫液選擇0.8 mol·L-1NaCl較為適宜。

圖7 洗脫劑濃度對洗脫率的影響

2.5.3 洗脫體積對洗脫效果的影響 采取靜態(tài)洗脫的方法，考察洗脫劑體積對洗脫率的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知，當洗脫劑體積達到60 mL(12倍樹脂體積)，洗脫率達到最大，當洗脫劑體積繼續(xù)增加時，洗脫率并沒有增加，反而稀釋了洗脫液中達托霉素的濃度，因此，洗脫劑的最佳洗脫體積為60 mL。

圖8 洗脫劑體積對洗脫率的影響

3 結(jié) 論

離子交換層析是利用離子交換劑為固定相，依據(jù)離子交換劑與溶劑之間的靜電作用差異而進行分離的一種技術(shù)，它對分離各種生化產(chǎn)品，特別是具有生物活性的生物大分子有良好的效果。它自20世紀40年代末問世以來，隨著高分子化學的發(fā)展，離子交換層析技術(shù)己被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽、環(huán)肽、核酸、寡聚核苷酸和其它帶電荷的生物分子的分離純化中。

本文在實驗室規(guī)模上初步確定了330陰離子交換樹脂純化Streptomyces roseosporus發(fā)酵液中達托霉素工藝,工藝如下：吸附方式為靜態(tài)吸附，吸附溫度為15℃～30℃,吸附液的pH 8.0～8.5，飽和吸附時間為10 h；最適洗脫方式為靜態(tài)洗脫，洗脫劑為0.8 mol·L-1NaCl水溶液，洗脫體積為12倍樹脂體積，洗脫時間為8 h。在優(yōu)化條件下，發(fā)酵液中達托霉素的純度由2%提高到了60%，回收率達87.5%。考慮到將來向工業(yè)化大生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的可能,在選擇制備工藝時,也注意了大規(guī)模生產(chǎn)時的可操作性以及物料節(jié)約問題。比如提取工藝,在不影響提取得率的前提下,減少了提取時間,有利于提高生產(chǎn)效率。在樹脂的選擇問題上,考察各種樹脂的吸附性能、價格、耐用性等因素。

在本實驗中，發(fā)現(xiàn)0.8 mol·L-1NaCl水溶液幾乎可以把結(jié)合在樹脂上的達托霉素全部洗脫下來，又因為在強酸或強堿環(huán)境下，都不利于達托霉素的穩(wěn)定性，因此，在本實驗中沒有對洗脫劑pH作進一步考察。

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