M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的條件優化

徐 楓 王和平 孫慶林 張雄杰 宋 敏

M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的條件優化

徐 楓 王和平 孫慶林 張雄杰 宋 敏

通過研究培養基料比、固液比、無機鹽、接種量以及培養時間等單因素對M-112木霉固態發酵羊胃容物的影響，并采用正交實驗設計優化了固態發酵條件。研究表明，M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶是可行的，影響產酶最主要的因素為接種量。優化的發酵條件為胃容物50%，玉米：麥麩=5：5，CaCl2濃度0.5%，初始pH值5.0，固液比1：3，每10 g干培養基接種量2 ml（孢子數1.2～1.6×108cfu/ml），發酵時間72 h,發酵溫度30℃。經優化后的酶活水平達到了138.504 IU/ml。較已報道的同種木霉的最高發酵酶活提高達3倍左右。

生物廢棄物；低碳經濟；羊胃容物；木霉；木聚糖酶；固態發酵

內蒙古有著豐富的牛羊資源，每年屠宰量巨大， 在屠宰牛羊的同時，會產生大量牛羊胃容物。據統計，每頭（只）成年牛羊屠宰后可產生0.5～1.5 kg風干瘤胃容物。反芻動物瘤胃容物是有待開發的可利用資源,其中含粗蛋白15.2%、粗纖維26.4%、粗脂肪6.2%、粗灰分12.1%、無氮浸出物40.1%、鈣0.71%、磷0.67%[1]。而且，其中還含有生物學價值很高的微生物菌體蛋白、維生素和各種消化酶，尤其富含維生素B12。目前胃容物作為垃圾處理，污染環境、滋生蚊蠅、產生惡臭。如何科學利用它們，設法變廢為寶，為科技人員提出了一項低碳經濟研究的課題。

木霉（Trichoderma）可產木聚糖酶等，對纖維素、半纖維素類物質有較好的降解能力[2]。木聚糖酶能降解木聚糖中的 β-1，4糖苷鍵，去除小麥、黑麥、燕麥等谷物飼料中的抗營養因子，改善動物生產性能，補充內源酶分泌的不足，促進養分的消化和吸收，提高飼料利用率，減輕糞便對環境的污染，同時還可開發非常規谷物資源[3]。

本文通過單因素以及正交實驗，研究木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的最佳發酵條件，設法盡可能多地利用目前屠宰后的胃容物垃圾，其研究結果可為放大木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的最佳發酵工藝條件提供可靠的參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品

木聚糖 （Xylan/Sigma）、木糖 （Xylose/Merck）、3,5-二硝基水楊酸 （均為化學純）；（NH4）2SO4、葡萄糖、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、酒石酸鉀鈉、結晶酚、無水乙醇、冰醋酸、無水乙酸鈉、FeSO4、KCl、ZnSO4、NaCl、MnSO4、BaCl2、MgCl2、CaCl2、CuSO4（ 均 為 分 析純）；無菌去離子水、瓊脂、麥麩、玉米粉。

1.1.2 儀器

高速冷凍離心機（HITACHI SCR20BC）、恒溫培養箱（上海福瑪）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海新苗）、高壓滅菌鍋（TOMY SX-500）、恒溫水浴鍋（天津華北HHS）、磁力攪拌器、精密pH計（雷磁 PHS-3B）、電子精密天平 （OHAUS AR2140）、TU-1800型紫外分光光度計（北京普析TU-1800PC）、光學顯微鏡（Olympus C011）等。

三角瓶（100 ml、250 m）l、燒杯（50 ml、100ml、200ml、500 ml、1 000 m）l、容量瓶（50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1 000 ml）、培養皿（Φ80 mm）、血細胞計數板、蓋玻片、無菌毛細滴管等。

封口膜、接種針、移液器（1 ml、2 ml、5 ml）等。

1.1.3 菌種

M-112木霉（M-112Trichoderma）由本研究室提供。

1.1.4 羊胃容物

采自呼和浩特市某屠宰場，濕物料經高壓滅菌，風（烘）干，粉碎，過40目篩后，置于干燥器中備用。

1.1.5 培養基

1.1.5.1 傳代培養基[馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基]

馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水1 000 ml，pH 值 7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌 20 min，分裝備用。

1.1.5.2 基本固體培養基（麥麩、玉米）

麥麩 250 g、玉米粉 250 g、FeSO40.1%、去離子水1 500 ml,混勻，121℃高壓滅菌40 min，備用。

1.1.6 溶液

1.1.6.1 0.2 mol/l pH值5.8乙酸鈉緩沖液

溶液A:量取冰乙酸11.80 ml，用去離子水定容至1 000 ml，混勻后備用。

溶液B:準確稱取1.642 g乙酸鈉（無水），用少量去離子水溶解后定容至100 ml，混勻后備用。

0.2 mol/l pH值5.8乙酸鈉緩沖液：取A液940 ml、B液60 ml，混勻即成。

1.1.6.2 1%木聚糖（Xylan）溶液

準確稱取木聚糖（Xylan）1.00 g，用少量0.2 mol/l pH值5.8乙酸鈉緩沖液溶解后定容至100 ml，混勻即成（4℃冷藏備用）。

1.1.6.3 DNS（3,5-二硝基水楊酸）溶液

準確稱取3,5-二硝基水楊酸 6.30 g于500 ml燒杯中，用少量去離子水溶解后，加入2 mol/l NaOH溶液260 ml，然后移加到500 ml含有18.5 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結晶酚和5 g無水亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后移入1 000 ml容量瓶中定容至1 000 ml，充分混勻，貯存于棕色瓶中，室溫放置一周后使用。

1.1.6.4 1 mg/ml標準木糖（Xylose）溶液

標準稱取木糖（Xylose）50.0 mg，用少量去離子水溶解，然后加1 mg疊氮化鈉（防腐），再用去離子水定容至50 ml，混勻即成（4℃冷藏備用）。

1.2 方法

1.2.1 木糖標準曲線的繪制

圖1 木糖標準曲線

將木糖標準溶液制成如圖1所示的濃度梯度，用DNS法測定（OD550）木糖含量。以木糖濃度梯度為縱坐標，木糖濃度梯度對應的吸光度值（OD550）為橫坐標，使用軟件origin7.5進行線性擬合[4]，建立木糖標準曲線，得到回歸方程y=0.865 9x+0.113 4，R2=0.997 2。

1.2.2 木聚糖酶的活性測定

1.2.2.1 粗酶液的制備

取固態發酵物，按1：5加入0.2 mol/l pH值5.8的乙酸鈉緩沖液，充分攪拌，將發酵物混勻，40℃水浴加熱1 h，取提取液5 ml,經4 200 r/min，4℃下離心10 min,取清液，用醋酸鈉緩沖液稀釋10倍，即為粗酶液。

1.2.2.2 木聚糖酶的活性測定（DNS法）

在試管（做三個平行）中加粗酶液0.1 ml，0.2 mol/l pH值5.8醋酸緩沖液5.5 ml，1%木聚糖溶液0.9 ml，搖勻，50℃水浴30 min（準確）。酶解完畢后取出，加DNS試劑1 ml搖勻，立即沸水浴加熱10 min，冷卻后，于550 nm下測OD值。由回歸方程及酶活定義計算酶活性。

空白管，不加底物，即用0.2 mol/l pH值5.8醋酸緩沖液代替1%木聚糖溶液加入的量，其他與待測樣管相同。

木聚糖酶活力單位定義：在最適條件下，每分鐘分解10 mg/ml木聚糖溶液產生1 μmol還原糖（木糖）的酶量,定義為一個木聚糖酶活力單位（U/ml）。

式中：A——所測吸光度值在標準曲線上對應的還原糖（木糖）量（mg），即用該回歸方程所計算的值；

B——酶液的稀釋倍數；

30——酶促反應的時間（min）；

10——測定所用的0.1 ml酶液折算成1 ml酶液的換算值；

1 000——毫克還原糖（木糖）單位折算成微克還原糖（木糖）單位的換算值；

150.14——木糖（Xylose）的相對分子質量。

1.2.3 M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的條件優化

1.2.3.1 固態發酵條件的單因素實驗研究

①羊胃容物固態培養基接種量實驗

調整接種懸液孢子數為1.2～1.6×108cfu/ml。設置接種量梯度（10 g干培養基），1、2、3、4、5 ml,共 5 個處理，每個處理3個重復，羊胃容物添加量為50%，固液比為1：3，30℃下培養72 h；制備粗酶液；DNS法測定木聚糖酶活性。結果圖示為均值與標準偏差。

②羊胃容物固態培養基固液比實驗

設置固液比梯度（10g干培養基/100ml三角瓶中），1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5、1：5，共9個處理，每個處理3個重復,羊胃容物添加量為50%，每10 g干培養基接種量為3 m（l1.2～1.6×108cfu/ml），30℃下培養72 h；制備粗酶液；DNS法測定木聚糖酶活性。結果圖示為均值與標準偏差。

③羊胃容物與基本固體培養基比例實驗

羊胃容物與基本固體培養基之比分別為2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2，共 7 個處理，每個處理3個重復，每10 g干培養基接種量為3 m（l1.2～1.6×108cfu/ml），固液比為 1：3，30 ℃下培養 72 h；制備粗酶液；DNS法測定木聚糖酶活性。結果圖示為均值與標準偏差。

④羊胃容物固態培養基添加無機鹽實驗

在設定培養基中，分別添加0.1%的無機鹽（Ca2+、K+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ba2+、Na+、Mn2+），共 9 個處理，每個處理3個重復，羊胃容物添加量為50%，固液比為1：3，每10g干培養基接種量為3 m（l1.2～1.6×108cfu/m）l，30℃下培養72 h；制備粗酶液；DNS法測定木聚糖酶活性。結果圖示為均值與標準偏差。

1.2.3.2 固態發酵條件的正交實驗研究

在以上單因素實驗研究的基礎上，進行5因素5水平的正交實驗。

2 結果與分析

2.1 不同單因素對M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的影響

2.1.1 接種量對M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的影響

圖2 接種量對木聚糖酶活力的影響

通過 5 個接種量（1、2、3、4、5 ml）的實驗，其研究結果表明（見圖2），3 ml的接菌量（1.2～1.6×108cfu/m）l，使該M-112木霉固態發酵羊胃容物產生的木聚糖酶較多。

一般微生物發酵速度的快慢，常取決于接種量的多少。接種量大，有利于基質的利用，可以縮短發酵環境中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產物合成提前到來，并且生產菌迅速占據整個培養環境，可減少雜菌生長的機會。但是，接種量過多，往往使菌絲生長過快，培養液黏度增加，則造成溶解氧不足而影響產物的合成。接種量過小，則除了延長發酵周期之外，往往還會引起其它不正常的情況[5]。較為合適的接種量，則會提升產物合成的水平。

2.1.2 固液比對M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的影響（見圖3）

圖3 固液比對木聚糖酶活力的影響

通 過 9 個 固 液 比（1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5、1：5）的實驗，其研究結果表明，固液比為1：3時，使該M-112木霉固態發酵羊胃容物產生的木聚糖酶較多。

水是微生物生長代謝必不可少的物質,也是發酵的主要媒介,因而培養基中含水量的變化必然對微生物的生長及代謝能力產生重要影響。固液比較大，會造成物料含水量較低，而導致物料膨脹程度低，并在發酵后期由于蒸發作用使物料干化，從而抑制菌體生長，而造成產物產量降低。固液比較小，則含水量較高，會使物料多孔性降低,減少了物料內氣體交換、通風和降溫,不利于木霉的菌體生長和對培養基中木聚糖的降解[6]。

2.1.3 胃容物與基本固體培養基比例對M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的影響（見圖4）

圖4 胃容物添加量對木聚糖酶活力的影響

通過7個羊胃容物與基本固體培養基之比（2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2）的實驗，其研究結果表明，羊胃容物與基本固體培養基之比為5：5時，使該M-112木霉固態發酵羊胃容物產生的木聚糖酶較多。

羊胃容物含有蛋白和纖維素以及種類豐富的無機鹽等，但是也含有一些抑制木霉發酵的因素。通過控制羊胃容物加入量，一方面盡可能多的利用羊胃容物，另一方面使其產木聚糖酶盡可能的多。

2.1.4 無機鹽離子對M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的影響（見圖5）

通過分別添加9種不同無機鹽離子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+）的實驗，其研究結果表明，所選的這些離子都具有促進M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的作用，但Ca2+的促進作用最大。

圖5 無機鹽離子對木聚糖酶活力的影響

微生物生長過程中需要某些無機鹽和微量元素，調節滲透壓和透性、穩定環境pH值、構成生物物質、生理調節、促進菌絲體的增殖等[7-8]。這些物質一般在低濃度時對微生物生長和產物合成具有促進作用，在高濃度時常表現出明顯的抑制作用。

2.2 M-112木霉固態發酵羊胃容物的正交實驗研究

采用L25（55）正交設計法進行5因素5水平正交實驗[9]，其研究結果表明（如表1、效應曲線圖6所示），M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的優化條件為A3B1C2D5E2,其酶活達到138.504 IU/ml。

由極差分析可知，在M-112木霉固態發酵羊胃容物的過程中，各因素對發酵產木聚糖酶活性的影響程度有所不同，其影響程度由大到小順序依次為：接種量＞發酵時間＞玉米與麥麩比例＞無機鹽濃度＞初始pH值。接種量與發酵時間是M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶生產工藝中最主要的影響因素，只有控制最合適的接種量和發酵時間才能產生更多的木聚糖酶。初始pH值對羊胃容物固態發酵的影響較小，說明M-112木霉固態發酵羊胃容物對pH值變化具有一定的自我調節和適應能力。

表1 正交實驗結果

圖6 效應曲線

3 結論

通過培養基料比、固液比、無機鹽、接種量、培養時間等單因素以及正交實驗對M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的影響研究，其優化條件為：胃容物 50%、玉米：麥麩=5：5、無機鹽（CaCl2）濃度0.5%、初始pH值5.0、固液比 1：3，每10 g干培養基接種量 2 ml（孢子總數 1.2～1.6×108cfu/ml），發酵時間72 h,發酵溫度30℃，M-112木霉固態發酵羊胃容物產生的木聚糖酶活性可達到138.504 IU/ml，較已報道的同種木霉的最高發酵酶活提高達3倍以上[10]，證明M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶是可行的。實驗為放大M-112木霉固態發酵羊胃容物產木聚糖酶的最佳發酵工藝條件，設法盡可能多的利用目前屠宰后的胃容物垃圾變廢為寶（低碳經濟利用）提供了可靠的參考數據。

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TQ920.6

A

1001-991X（2011）04-0020-05

徐楓，內蒙古農業大學生命科學學院，010018，呼和浩特。

王和平（通訊作者）、孫慶林、張雄杰、宋敏，單位及通訊地址同第一作者。

2010-10-19

國家自然科學基金項目（39870558）

（編輯：高 雁，snowyan78@163.com）