復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕工藝的初步研究

劉建成 馬貴軍 蔣粒薪

復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕工藝的初步研究

劉建成 馬貴軍 蔣粒薪

文章以枯草芽孢桿菌屬、酵母菌屬和乳酸菌屬的6株菌為出發(fā)菌株，通過單因素試驗和正交試驗，確定了6株菌復(fù)合培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為：糖蜜40 g/l、蛋白胨10 g/l、葡萄糖1 g/l、磷酸氫二鉀0.5 g/l；并對復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕工藝條件進(jìn)行了研究，確定了復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的最適工藝條件為：料水比1：0.8，接種量為3%，發(fā)酵溫度為30℃，pH值自然，發(fā)酵時間為48 h。在以上條件下，棉籽粕經(jīng)過復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵后，物料的pH值降低到4.5以下，有益菌總數(shù)達(dá)到6.2×108cfu/g，粗蛋白含量提高了1.76%，游離棉酚含量從618.52 mg/kg降低到274.16 mg/kg，降低了55.7%。

棉籽粕；復(fù)合菌；固態(tài)發(fā)酵；游離棉酚；脫酚率

棉籽粕（cottonseed meal,CSM）是棉籽經(jīng)脫殼、加熱、壓扁成薄片用溶劑浸出油后，所剩余的副產(chǎn)品。棉籽粕中含粗蛋白40%以上，還含有豐富的賴氨酸、蛋氨酸，是畜禽飼料中非常有價值的一種原料。我國是一個產(chǎn)棉大國，每年有1 100萬噸以上的棉籽，年可產(chǎn)棉籽餅粕600萬噸以上，資源量全球第一[1]。棉籽餅粕是一種極具開發(fā)潛力的植物蛋白飼料資源。但是，棉籽餅粕用作飼料存在三方面的不利因素：①棉籽餅粕含有有毒物質(zhì)游離棉酚，會對動物生產(chǎn)、發(fā)育和繁殖等方面產(chǎn)生不良影響[2-3]；②棉籽餅粕中含有纖維素、半纖維素等難以消化的物質(zhì)和植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子[4]；③蛋白質(zhì)品質(zhì)差，蛋氨酸等必需氨基酸含量低，賴氨酸易于與棉酚結(jié)合形成復(fù)合體，難以被動物利用。上述因素限制了棉籽餅粕安全而有效的用作動物蛋白飼料，部分地區(qū)甚至將其貶作肥料，造成飼料資源的嚴(yán)重浪費。因此，開展有效利用棉籽餅粕的研究，對促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義[5-9]。

棉籽粕發(fā)酵的研究最早是在我國上世紀(jì)70年代，在國外除了前蘇聯(lián)有少量報道外，基本上未見相關(guān)報道。微生物發(fā)酵法可以說是我國研究人員在棉籽粕脫毒研究領(lǐng)域采用的較獨特的一種技術(shù)手段[7-8]。微生物固態(tài)發(fā)酵的方法是通過微生物作用把棉籽粕中的棉酚有效去除，并通過微生物活動改變棉籽粕營養(yǎng)成分[9-10]，提高粗蛋白含量，尤其改善了粗蛋白的品質(zhì)及可利用性，并對棉籽粕蛋白質(zhì)進(jìn)行一定程度的降解，尤其是發(fā)酵降解產(chǎn)生的小分子多肽有利于畜禽的消化吸收，提高其利用率。微生物發(fā)酵能在脫毒的同時生成菌體蛋白和維生素[8]。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的益生菌、乳酸、未知生長因子等物質(zhì)，可以促進(jìn)腸道中乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌的增殖，維持腸道內(nèi)菌群平衡，提高免疫力，同時改善適口性、提高采食量[9-10]。

本文在總結(jié)以往棉籽粕單一菌種發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上[11-16]，對棉籽粕復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵的最適條件進(jìn)行篩選，以求在降低棉籽粕中游離棉酚含量的同時，能改善棉籽粕的營養(yǎng)價值和飼用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

枯草芽孢桿菌屬、酵母菌屬和乳酸菌屬共六株菌，全部購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

乳酸菌屬（g/l）：蛋白胨 10、牛肉膏 10、酵母浸膏5、葡萄糖 5、磷酸氫二鉀 2、乙酸鈉 5、檸檬酸銨 2、硫酸鎂 0.2、硫酸錳 0.05、吐溫80 1、瓊脂 20，pH值6.8，121℃高壓滅菌20 min。

枯草芽孢桿菌屬（g/l）：氯化鈉 0.5、牛肉膏 1、蛋白胨1、瓊脂15，pH值7.2，121℃高壓滅菌20 min。

酵母菌屬（g/l）：麥芽浸粉 1、葡萄糖 1、瓊脂 20，在121℃下高壓滅菌20 min。

初始復(fù)合菌培養(yǎng)基（g/l）：糖蜜 10、蛋白胨 10、葡萄糖 5、磷酸氫二鉀 2、硫酸鎂 0.2，pH 值 7.0～7.2，121 ℃高壓滅菌25 min。

最佳復(fù)合菌培養(yǎng)基（g/l）：糖蜜 40，蛋白胨 10，葡萄糖1、磷酸氫二鉀0.5、硫酸鎂0.2，pH值7.0～7.2，121℃高壓滅菌25 min。

1.1.3 固態(tài)發(fā)酵底物（g/kg）：棉籽粕 900，麩皮 95、天康原酶 5、糖蜜 10，121℃高壓滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 復(fù)合菌的培養(yǎng)方法

用1 ml無菌水將各菌菌體從斜面上洗下，接種于裝有50 ml種子培養(yǎng)基的200 ml大試管中，在智能生化培養(yǎng)箱中30℃靜止培養(yǎng)48 h。

1.2.2 復(fù)合菌培養(yǎng)基的優(yōu)化方法

試驗因子包括糖蜜濃度、蛋白胨濃度等影響復(fù)合菌生長的因素。優(yōu)化方法采用單次單因素法，然后進(jìn)行正交試驗，得出最優(yōu)結(jié)果。

1.2.3 棉籽粕固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化方法

將最佳條件下培養(yǎng)好的種子液以3%的接種量與水混勻，在與固體發(fā)酵培養(yǎng)基充分混勻后每袋200 g裝入采樣袋、密封，于培養(yǎng)箱中靜止發(fā)酵。優(yōu)化方法采用單次單因素法，根據(jù)發(fā)酵后物料感官指標(biāo)、pH值、細(xì)菌總數(shù)和粗蛋白含量確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.4 棉籽粕中各指標(biāo)測定方法

pH值的測定：雷磁pH計；

細(xì)菌總數(shù)的測定：飼用細(xì)菌總數(shù)的測定參考GB13093—91 的方法進(jìn)行[17]；

粗蛋白含量的測定：采用凱氏定氮法（GB6432—94）[17]；

棉酚含量的測定：采用苯胺法（GB13086—91）[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 糖蜜濃度對復(fù)合菌生長的影響（見圖1）

圖1 糖蜜不同濃度對復(fù)合菌體生長的影響

糖蜜是一種廉價的碳源，可為菌體的生長提供能源和合成菌體所必需的碳成分。為了研究不同糖蜜濃度對復(fù)合菌生長的影響，將糖蜜濃度設(shè)置成10、20、30、40、50 g/l，通過測定不同濃度條件下復(fù)合菌生長量（吸光度A600），以確定復(fù)合菌生長所需的最佳糖蜜濃度。

從圖1中可以看出，當(dāng)糖蜜濃度小于40 g/l時，隨著糖蜜濃度的增大，A600值逐漸增大而且增幅明顯，而當(dāng)糖蜜濃度從40 g/l增大到50 g/l時，其A600值增加較小。所以確定復(fù)合菌生長的最佳糖蜜濃度為40 g/l。

2.1.2 蛋白胨濃度對復(fù)合菌生長的影響

蛋白胨是一種很容易被微生物利用的良好氮源，因為它含有豐富的氨基酸、還原糖、磷等微量元素和生長素。為了研究蛋白胨濃度對復(fù)合菌生長的影響，將蛋白胨濃度設(shè)置成 5、10、15、20、25 g/l，通過測定不同濃度條件下復(fù)合菌生長量（吸光度A600），以確定復(fù)合菌生長所需的最佳蛋白胨濃度，結(jié)果見圖2。

圖2 蛋白胨不同濃度對復(fù)合菌生長的影響

從圖2中可以看出隨著蛋白胨濃度的增加菌體濃度也是逐漸增大的，但大于10 g/l后菌體濃度增幅不顯著。考慮到蛋白胨價格昂貴和菌體種子液濃度的需要選擇10 g/l的蛋白胨為最佳濃度。

2.1.3 復(fù)合菌最佳生長培養(yǎng)基的確定

為了考察復(fù)合菌培養(yǎng)基中4大影響因素：糖蜜、蛋白胨、葡萄糖和磷酸氫二鉀對菌體生長影響的相互作用，以單因素試驗的結(jié)果為參考，設(shè)計L9（34）正交試驗，因素水平如表1所示，正交試驗結(jié)果見表2，以復(fù)合菌生長量（A600）為指標(biāo)繪制曲線圖見圖3。

表1 復(fù)合菌培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗因素水平

正交實驗結(jié)果表明，各個因素的最佳濃度為糖蜜50 g/l，蛋白胨 15 g/l，葡萄糖 1 g/l，磷酸氫二鉀 0.5 g/l。其中，菌體濃度隨著糖蜜濃度的增加而增大；蛋白胨濃度從5 g/l增加到10 g/l時，菌體濃度增加明顯，而當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葟?0 g/l增加到15 g/l時，菌體濃度增加不明顯。考慮到新疆糖蜜資源匱乏，糖蜜、蛋白胨原料成本較高，為了能降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，綜合單因素試驗結(jié)果，確定培養(yǎng)基中影響菌體生長的四個因素的最佳組合為：糖蜜40 g/l，蛋白胨10 g/l，葡萄糖1 g/l，磷酸氫二鉀0.5 g/l。

表2 復(fù)合菌培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗及結(jié)果

圖3 復(fù)合菌培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗結(jié)果

2.2 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵條件的研究

為了使復(fù)合菌在發(fā)酵底物中能充分生長，還必須滿足復(fù)合菌對環(huán)境條件的要求，使其處于生長的優(yōu)化環(huán)境中。本試驗就料水比、接種量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間等影響棉籽粕復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵的環(huán)境條件進(jìn)行了研究。

2.2.1 料水比對固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的影響

水分對微生物的生長繁殖和產(chǎn)物合成極為重要。所以在固體發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基水分含量十分重要，發(fā)酵物料中的水分既是微生物進(jìn)行物質(zhì)交換的媒介，又是其生存的環(huán)境條件。水分含量過低，滿足不了微生物生長的需要，有機物難以分解；水分含量過高，則易堵塞料堆中的空隙，使氧氣含量減少，影響微生物的發(fā)酵作用。本試驗對固態(tài)發(fā)酵不同料水比1：0.4、1：0.6、1：0.8、1：1和 1：1.2進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖 4。

由于發(fā)酵所用的復(fù)合菌中大多數(shù)為細(xì)菌，而細(xì)菌對水分的要求較高，所以從圖4中可以看出，隨著料水比的增加，菌體量成逐漸增大趨勢，并且pH值隨著菌體量的增大而逐漸減小。但在大工業(yè)生產(chǎn)中，過高的水分含量容易引進(jìn)雜菌污染，并顯著增加烘干成本。因此，確定物料發(fā)酵的最佳料水比為1：0.8。

圖4 不同料水比對棉籽粕固態(tài)發(fā)酵的影響

2.2.2 接種量對固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的影響

菌種接種量的大小對發(fā)酵的影響也比較大，其直接影響發(fā)酵時間。接種量太小，菌體增長緩慢，培養(yǎng)時間長，使發(fā)酵周期延長，同時會降低菌種活力，不利于發(fā)酵。但接種量過大，會顯著增加成本。為了考察復(fù)合菌接種量對發(fā)酵棉籽粕的影響，在其它發(fā)酵條件相同的情況下，進(jìn)行了不同接種量1%、3%、5%、7%和10%條件下的發(fā)酵試驗，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同接菌量對棉籽粕固態(tài)發(fā)酵的影響

從圖5中可以看出，隨著接菌量的增大，發(fā)酵后物料中細(xì)菌總數(shù)逐漸增大，但pH值變化不顯著，說明接菌量在所選范圍內(nèi)都能達(dá)到棉籽粕發(fā)酵的要求。因此，確定其最佳接菌量為3%。

2.2.3 溫度對固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的影響

適宜的培養(yǎng)溫度對微生物的生長也是必不可少的。對不同溫度20、25、30、35和40℃下復(fù)合菌發(fā)酵棉籽粕的品質(zhì)進(jìn)行了比較研究，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可以看出，當(dāng)溫度低于20℃后，不利于復(fù)合菌的生長。當(dāng)溫度在20～40℃變化時，隨著發(fā)酵溫度的增加，菌體量逐漸增大。當(dāng)溫度從20℃增加到30℃的過程中,發(fā)酵物料的菌體量從34×106cfu/g增加到207×106cfu/g,增大了約6倍。pH值從5.2降到4.18，降低了1.02。溫度從30℃增大到40℃過程中，菌體量增加不明顯，pH值從4.18降到4.02，變化也不明顯。考慮到在大生產(chǎn)中大宗物料不易加熱，為了盡量降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，選擇復(fù)合菌的最佳發(fā)酵溫度為30℃。

圖6 不同溫度對棉籽粕固態(tài)發(fā)酵的影響

2.2.4 發(fā)酵時間對固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的影響

棉籽粕營養(yǎng)性能的改善依賴的是微生物的作用，微生物的生長與發(fā)酵時間有著直接的關(guān)系。為此我們研究了不同發(fā)酵時間對棉粕固態(tài)發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果如圖7。

圖7 不同發(fā)酵時間對棉籽粕固態(tài)發(fā)酵的影響

從圖7中可以看出，0～24 h，菌體量迅速增長，pH值從6.05快速降為4.40。24～48 h，菌體量繼續(xù)增加，pH值降至4.14。48～96 h，菌體量開始下降，在此期間pH值變化不大。說明經(jīng)過48 h發(fā)酵之后，菌體量就可達(dá)到最大值，同時由于復(fù)合菌中乳酸菌的大量生長，產(chǎn)生有機酸及一些芳香性物質(zhì)，可使得物料有明顯的酸香味，提高了物質(zhì)的感官品質(zhì)。

2.3 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵前后比較結(jié)果（見表3）

表3 最適條件下復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵前后比較結(jié)果

在以上所有最適條件下，研究了復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵對棉籽粕營養(yǎng)價值的影響，發(fā)酵前與發(fā)酵后的對比結(jié)果。

3 討論

3.1 復(fù)合菌種的培養(yǎng)

本研究采用了6種不同菌種對棉籽粕進(jìn)行了混合菌固態(tài)發(fā)酵，混合菌種是以各單一菌種為基礎(chǔ)，按1：1接入種子培養(yǎng)基中，經(jīng)過增殖培養(yǎng)而得到種子菌液。在種子菌液培養(yǎng)過程中，由于各個菌生長性能不同，因此在增殖培養(yǎng)后的種子菌液中各個菌的比例可能改變，并影響固態(tài)發(fā)酵，所以有必要進(jìn)一步研究以確定棉籽粕固態(tài)發(fā)酵時接入的各個菌實際含量，從而更進(jìn)一步提高發(fā)酵棉籽粕的營養(yǎng)價值。

3.2 發(fā)酵棉籽粕中蛋白質(zhì)的變化

在固態(tài)發(fā)酵過程中，我們測定了發(fā)酵前后的蛋白質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)粗蛋白變化不顯著。而浙江大學(xué)顧賽紅等用黑曲霉PES對棉籽粕進(jìn)行固體發(fā)酵，使棉籽粕的粗蛋白提高了10.92%[12]。石河子大學(xué)張文舉等利用由乳酸菌與酵母菌等主要有益菌組成的復(fù)合菌發(fā)酵棉籽殼，發(fā)酵后棉酚含量降低，脫毒率達(dá)到75.4%，粗蛋白（CP）提高2.29%[13]。如何能通過微生物的發(fā)酵作用進(jìn)一步提高棉籽餅粕的粗蛋白含量有待于進(jìn)一步研究。復(fù)合菌的發(fā)酵作用能否將棉籽粕的大分子蛋白質(zhì)降解為動物更易消化吸收的小分肽，有待于進(jìn)一步測定。

3.3 發(fā)酵工藝

為了適應(yīng)工業(yè)化大生產(chǎn)，本研究采用了原料不滅菌而直接接入復(fù)合菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的工藝，簡化了生產(chǎn)步驟并省去了大量的能源成本。所需發(fā)酵溫度范圍廣，發(fā)酵條件要求不高，而發(fā)酵結(jié)果非常好，有利于實現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。

4 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗，確定了復(fù)合菌生長的最適培養(yǎng)基配方為：糖蜜40 g/l、蛋白胨10 g/l、葡萄糖1 g/l、磷酸氫二鉀0.5 g/l。對棉籽粕復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了研究，確定了復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的最適工藝條件為：料水比1：0.8，接種量為3%，發(fā)酵溫度為30℃，pH值為發(fā)酵的起始值，發(fā)酵時間為48 h。

在最適條件下通過復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵可使棉籽粕pH值從6.13降至4.25，有益菌總數(shù)增加到幾千萬個，棉酚含量降至274.16 mg/kg，降低了55.67%，達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定以下。粗蛋白含量提高1.76%，并且使棉籽粕產(chǎn)生了另人愉悅的酸香氣味，提高了誘食性。為工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵棉粕具有一定的指導(dǎo)意義。

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[17] 飼料行業(yè)國家標(biāo)準(zhǔn)（2009）.

The preliminary study of composite strain solid-state fermentation cottonseed meal

Liu Jiancheng,Ma Guijun,Jiang Lixin

In this paper,bacillus subtilis,yeasts and lactic acid bacteria is a strain of 6 as the starting strain,through a single test and single-factor orthogonal experiment,six strains identified the best coculture medium as follows:molasses 40 g/l,peptone 10 g/l,glucose 1 g/l,K2HPO40.5 g/l;and cottonseed meal composite solid-state fermentation conditions for bacteria to carry out a study to determine the composite solid-state fermentation bacteria cottonseed meal the optimum conditions were as follows:water ratio 1：0.8 material,inoculum was 3%,fermentation temperature is 30℃,pH value of the start value for the fermentation,the fermentation time of 48 h.In these conditions,cottonseed meal bacteria through complex solid-state fermentation,the fermentation the pH values were reduced to below 4.5,the total number of bacteria 6.2×108cfu/g,the crude protein content increased 1.76%,free gossypol content reducing 618.52 mg/kg to 274.16 mg/kg,decreased 55.7%.

cottonseed meal；composite strain；solid-state fermentation；free gossypol；phenol removal rate

S816.34

A

1001-991X（2011）07-0032-05

劉建成，新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生物添加劑分公司，工程師，830011，新疆烏魯木齊市安寧渠路2號。

馬貴軍、蔣粒薪，單位及通訊地址同第一作者。

2011-01-11

（編輯：劉敏躍，lm-y@tom.com）