魷魚皮膠原蛋白提取前處理的條件優化

王 燕 付萬冬 吳亮亮 鄭 斌

魷魚皮膠原蛋白提取前處理的條件優化

王 燕 付萬冬 吳亮亮 鄭 斌

試驗測定了魷魚皮的基本組成成分，探索了酶法提取魷魚皮膠原蛋白時前處理的最佳條件。選定了4個因素，3個水平，采用L9（34）正交試驗確定了最佳條件。結果表明，4個因素NaOH濃度，NaOH作用時間、異丙醇濃度、活性炭濃度的最佳選擇分別為0.15 mol/l、6 h、12%、0.8%，此時提取的膠原蛋白含量為11.08%，提取率為93.6%。

魷魚皮；膠原蛋白；提取；前處理

我國水域遼闊，漁業發達，魷魚資源突飛猛進，然而魷魚在加工為魷魚干、魷魚花、罐頭及調味品等處理過程中約有35%的魷魚頭、足、內臟及表皮等廢棄物產生,其中魷魚皮占8%～13%[1]。對這些廢棄物的處理,大多數工廠則采用了掩埋丟棄的方法 ,這不僅造成資源的極大浪費，更嚴重的是直接導致環境的污染。國外有研究發現，魷魚皮中膠原蛋白（collagen）含量較高[2]，牛和豬的皮通常是膠原蛋白的主要來源，然而，牛海綿狀腦病、傳染性海綿狀腦病和口蹄疫的爆發使得人們對陸生動物來源的膠原蛋白及其衍生產品的安全性產生恐慌[3]。因此用魷魚皮來提取生產膠原蛋白就顯得非常迫切和有意義。

有研究報道，膠原蛋白的氨基酸組成非常適合魚蝦,甘氨酸、丙氨酸是魚蝦的引誘劑,可以使魚蝦易接受到食物信息,并快速、準確捕捉到食物。天門冬氨酸等能提高魚蝦的抗病能力，精氨酸促進魚蝦的生長。若把膠原蛋白制作成膠原蛋白粉，其粘結性,可作為顆粒飼料的粘合劑 ,應用于水產飼料生產，可明顯提高顆粒飼料在水中的穩定性，既可提高飼料利用率，又不易污染水質,明顯降低養殖成本[4-5]；同時，膠原蛋白中的脯氨酸和羥脯氨酸,能顯著促進毛發的生長,這是其它蛋白質所不可及。用于水貂、麝鼠、狐貍等名貴動物的飼料,提高它們的毛皮等級。同時也可用于牧區的羊飼料。膠原蛋白體內水解后的一些特殊肽鏈片段,具有免疫增強劑功效,起到抑制和殺滅病菌和病毒的作用,既起到保健作用，又可以提高羊毛的質量[6-7]。

從魷魚皮中提取膠原蛋白首要做的就是去除非膠原蛋白，脫色，脫腥等前處理過程，此過程的不同將對最終所得膠原蛋白質量及提取率有很大影響，本試驗的目的就是探索出最佳前處理條件，希望對后期的提取工作有所幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

魷魚皮取自浙江興業集團有限公司，摘掉上面的吸盤，清洗干凈，剪成約1 cm長和寬的小塊，放在-20℃中保存，備用，試驗時4℃解凍。

1.2 儀器與藥品

DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱，JJ-1精密增力電動攪拌器，KDN-08C定氮儀，脂肪測定儀，數顯恒溫水浴鍋HH-4，JJ-2組織搗碎勻漿機，超聲波清洗機，UV-2102C紫外可見分光光度計，電熱套，XW-80A漩渦混合器，DELTA320 pH計，TCL冰箱。

對二甲基氨基苯甲醛，氯胺T，檸檬酸，高氯酸，NaOH,正丁醇，鹽酸，L-羥脯氨酸，無水乙醇，濃硫酸等均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 成分測定

魷魚皮經解凍瀝干，剪碎后組織搗碎。魷魚皮中的水分、灰分、粗蛋白及粗脂肪按常規方法進行測定[8]，魷魚皮中總糖采用改良的苯酚-硫酸法進行測定[9]。

1.4 提取率的確定

提取前膠原蛋白含量的測定：準確稱取經前處理的魷魚皮1 g于碘量瓶中，加入6 M的鹽酸50 ml，用電熱套130℃水解8 h,水解完成后將水解物用純水定容到100 ml，用濾紙過濾，收集濾液于錐形瓶中，取濾液1ml，用0.1mol/lNaOH調節到pH=7.0，定容到50 ml備用。取1 ml按上述方法測3個吸光值求平均值，根據回歸方程求出羥脯氨酸的濃度，根據下式便知這1 g魷魚皮中所含羥脯氨酸的質量：W=5 000 h×10-6,h是所測得的濃度。

提取后膠原蛋白含量的測定：取木瓜蛋白酶酶解后的上清液5 ml，加入5 ml 6 M的鹽酸，置于130℃烘箱中水解4 h。取1 ml水解液用純水定容到100 ml，取其中的1 ml溶液于試管中，按上述測標準曲線的方法測吸光值，根據回歸方程求出羥脯氨酸的濃度，再推測出1 g的魷魚皮中所含的羥脯氨酸的質量。

1.5 標準曲線的繪制[11]

制備羥脯氨酸標準儲存液及標準工作液。準確吸取羥脯氨酸標準工作液 1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 ml，分別用純水定容到100 ml，則分別是濃度為1、2、2.5、3、3.5、4、4.5 μg/ml。分別加入上述各濃度的標準液1 ml于試管中，分別加入1 ml檸檬酸緩沖液和1 ml 0.05 mol/l氯胺T溶液，25℃下氧化10 min，加入高氯酸1 ml，放置10 min，最后加入對二甲氨基苯甲醛1 ml，在65℃水浴顯色10 min，冷卻后在560 nm處測吸光值。以羥脯氨酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，求出回歸方程和相關系數。

1.6 正交試驗

前處理條件優化。選擇NaOH濃度，NaOH作用時間，異丙醇濃度，活性炭濃度為因素，每個因素確定3個水平，按L9（34）正交表進行正交試驗。其正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

2 結果與討論

2.1 魷魚皮的成分

按1.3節的方法，測得本次試驗所使用魷魚皮的基本組成成分（濕基）見表2。

從表2中可以看出，魷魚皮雖然是水產品加工的廢棄物，但是其中含有豐富的蛋白質，粗蛋白含量達15.98%，經測定，魷魚皮中Hyp含量為0.78%，由于Hyp含量與膠原蛋白的含量呈正相關性，所以乘以14.2[5]得到魷魚皮中膠原蛋白的含量為11.1%，占總蛋白質的69.46%。因此，研究從魷魚皮中提取膠原蛋白非常有意義。

表2 魷魚皮基本組成成分

2.2 羥脯氨酸標準曲線的測定

按照1.5節的方法，測定羥脯氨酸的標準曲線，羥脯氨酸標準樣品的質量濃度和吸光值如表3所示：

表3 濃度與吸光值對照

根據測定的數值，以羥脯氨酸質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線（見圖1），并計算出回歸方程為：y=0.096 3x+0.004 8，羥脯氨酸濃度與吸光值之間的線性相關系數r2=0.998 2（P＜0.001）,顯示出羥脯氨酸濃度與吸光值之間有良好的線性相關關系。

圖1 標準曲線

2.3 正交試驗

按照1.6節的方法，選擇了前處理中的4個因素，每個因素確定了3個水平，按L9（34）正交表進行正交試驗，結果如表4所示。

對表4的試驗數據進行極差分析，發現影響因素依次為 A＞C＞D＞B,最佳試驗組合為 A2B2C3D2，再將該組合與正交試驗中提取率最高（93.6%）的試驗組合A2B2C3D1進行對比試驗，結果表明，極差分析得到的最佳試驗組合A2B2C3D2條件下膠原蛋白的提取率（92.7%）較A2B2C3D1略低。所以，確定A2B2C3D1為最佳試驗組合，即酶法提取魷魚皮膠原蛋白前處理的最佳條件為：NaOH濃度為0.15 mol/l,NaOH作用6 h，異丙醇濃度為12%，活性炭濃度為0.8%。

表4 正交試驗結果

2.4 討論

膠原蛋白溶于酸溶液和熱水中，不溶于水和稀堿溶液，為堿不溶性蛋白[12]，去除非膠原蛋白一般采用低濃度的NaOH溶液，濃度不能太大，否則會使膠原蛋白變性。脫脂前后測定魷魚皮中羥脯氨酸含量，結果有顯著性差異，采用ISO方法直接測定的結果顯著低于經過脫脂處理的測定結果，說明脂質對魷魚皮中的羥脯氨酸含量測定影響很大，因此提取魷魚皮膠原蛋白和測定膠原蛋白含量時，宜先進行脫脂處理[1]。

3 結論

魷魚皮中膠原蛋白的含量較高，膠原蛋白占總蛋白的69.46%，是值得開發利用的寶貴資源。魚皮膠原蛋白的開發需要進一步研究，使其在食品、醫藥、化妝品、飼料、肥料等工業中得到更加廣泛的應用。

在提取過程中發現前處理中所用藥品的量及作用時間不同時，提取總量也會不同，故做此試驗探索前處理的最佳條件，使提取率盡量更高。

前處理的最佳條件為：NaOH濃度為0.15 mol/l,NaOH作用6 h，異丙醇濃度為12%，活性炭濃度為0.8%，提取率為93.6%。

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[3] Yan Zhang，Wentao Liu，Guoying IA，et al.Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp（Ctenopharyngodon idella）[J].Food Chemistry，2007，103：906-912.

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The optimal pretreatment conditions for collagen from squid skin

Wang Yan,Fu Wandong,Wu Liangliang,Zheng Bin

To explore the components of squid skin and the optimal pretreatment conditions for extract collagen from squid skin by protease.Select four factors,three levels for each one,by L9（34）orthogonal experiment,the optimal conditions were determined.Results show,that the optimal selection for the four factors sodium hydroxide concentration,sodium hydroxide effect time,isopropyl alcohol concentration,activated carbon concentration were 0.15 mol/l,6 h,12%,0.8%,respectively.By this methods the content of collagen was 11.08%,extraction yield of collagen was 93.6%.

squid skin；collagen；extraction；pretreatment

S816.35

A

1001-991X（2011）07-0018-03

王燕，浙江海洋學院,316000，浙江省舟山市文化路105號浙江海洋學院005信箱。

付萬冬、鄭斌（通訊作者），浙江省海洋開發研究院。

吳亮亮，單位及通訊地址同第一作者。

2011-01-05

浙江省重大科技項目,項目編號：2009C13SAA00050

（編輯：劉敏躍，lm-y@tom.com）