納米級小肽螯合銅對小白鼠銅排泄和免疫指標(biāo)的影響

王衛(wèi)國 張?zhí)煊?/p>

納米級小肽螯合銅對小白鼠銅排泄和免疫指標(biāo)的影響

王衛(wèi)國 張?zhí)煊?/p>

試驗(yàn)的目的是考查以硫酸銅、堿式氯化銅、蛋氨酸銅、納米銅和納米小肽螯合銅等不同銅源供給形式對小白鼠銅排泄和血液免疫指標(biāo)的影響。試驗(yàn)將120只18日齡小白鼠隨機(jī)分為Ⅰ（小肽+硫酸銅組）、Ⅱ（硫酸銅組）、Ⅲ（堿式氯化銅組）、Ⅳ（蛋氨酸銅組）、Ⅴ（納米銅組）和Ⅵ（納米小肽螯合銅）等6個(gè)處理組,每個(gè)處理組設(shè)4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)5只小白鼠。飼喂試驗(yàn)分0～5、6～12、13～19、20～26和27～33 d 5個(gè)階段。其中0～5 d為預(yù)飼期，后4個(gè)階段為試驗(yàn)期。預(yù)飼期和試驗(yàn)期各處理組采用相同的基礎(chǔ)日糧。試驗(yàn)期Ⅰ～Ⅵ組飼糧銅的含量（以銅計(jì)）在6～12、13～19、20～26和27～33 d 4個(gè)階段分別為2.5、5、10及15 mg/kg。結(jié)果表明，納米小肽螯合銅組小鼠的銅排泄量顯著低于其它各組。飼喂第2、3、4階段，納米小肽螯合銅組小鼠的血清免疫蛋白IgG、IgM、IgA、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及白介素-2（IL-2）均極顯著（P＜0.01）高于其它各組。

小白鼠；納米級小肽螯合銅；銅排泄；免疫指標(biāo)

銅是飼養(yǎng)動物必需的微量元素，有重要的營養(yǎng)生理功能。同時(shí)對動物的免疫系統(tǒng)及抗氧化應(yīng)激也有強(qiáng)烈影響。但不同銅源的生物利用效率不同[1]。銅元素的總利用率較低，但促進(jìn)幼小動物生長作用明顯，導(dǎo)致飼料中銅元素超量添加的情況比較普遍，從而造成動物糞便中銅排泄量高，污染環(huán)境以及資源浪費(fèi)等問題[2]。因此，近年來，尋求具有高吸收利用率的銅源成為飼料研究的熱點(diǎn)之一。

納米小肽螯合銅是一種新的有機(jī)銅源，有關(guān)納米小肽螯合銅在動物飼養(yǎng)中的應(yīng)用效果的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)選擇小白鼠作為試驗(yàn)靶動物，研究在日糧中添加不同劑量的豆粕酶解小肽+分析純硫酸銅、分析純硫酸銅、堿式氯化銅、蛋氨酸銅、納米銅和本實(shí)驗(yàn)室制備的納米小肽螯合銅對小白鼠的銅排泄和主要免疫指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

納米小肽螯合銅由本實(shí)驗(yàn)室制備，平均粒度為216.6 nm。豆粕酶解小肽，本實(shí)驗(yàn)室制備；硫酸銅、堿式氯化銅、蛋氨酸銅和納米銅從市場購得。

IgG、IgM、IgA、定量ELISA試劑盒、小鼠白介素-2（IL-2）ELISA試劑盒、小鼠類胰島素樣生長因子-I（IGF-I）ELISA試劑盒均購于上海西唐生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動物及分組

130只18日齡健康昆明種小白鼠預(yù)飼5 d,挑選120只發(fā)育良好、體重差異不顯著的小鼠隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ6個(gè)處理組,每個(gè)處理組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只小白鼠。各重復(fù)間的雌雄數(shù)相等，雌雄分籠飼養(yǎng)。分組情況見表1。

表1 試驗(yàn)小白鼠分組情況

1.3 試驗(yàn)用飼糧及組成

基礎(chǔ)飼糧組成及各項(xiàng)營養(yǎng)指標(biāo)見表2，其中Cu含量為1.36 mg/kg飼料，粗蛋白含量為13.68%，均為實(shí)測值。

表2 小白鼠基礎(chǔ)日糧組成

試驗(yàn)中分別以飼料級硫酸銅、堿式氯化銅、蛋氨酸銅、納米銅、納米小肽螯合銅為原料調(diào)節(jié)基礎(chǔ)日糧中銅含量,將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ6個(gè)處理組所需日糧Cu含量配制成表3所示值。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3《實(shí)驗(yàn)動物小鼠、大鼠配合飼料》中推薦的小鼠日糧銅含量為大于等于10 mg/kg,而小鼠的營養(yǎng)需要量為5 mg/kg左右。這其中考慮了銅的利用率問題。本試驗(yàn)的4個(gè)階段中銅的供給量分別設(shè)為2.5、5、10、15 mg/kg，目的是考查不同劑量、不同銅源對小鼠銅利用效率和主要免疫指標(biāo)的影響。

表3 各處理組銅的添加量（mg/kg）

1.4 試驗(yàn)階段劃分與飼養(yǎng)管理

動物試驗(yàn)室預(yù)先清潔,熏蒸消毒。小鼠飼喂試驗(yàn)期為 33 d,分為 0～5（預(yù)飼期）、6～12、13～19、20～26 和27～33 d 5個(gè)階段,在試驗(yàn)期內(nèi),Ⅰ（對照組）、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ等6個(gè)處理組中，同一個(gè)階段日糧的銅添加量（以銅計(jì)）保持一致，自由采食、飲用去離子水。試驗(yàn)動物同室、同架,雌雄分籠飼養(yǎng)。采用自然光照明,通風(fēng)良好,室內(nèi)溫度18～25℃,相對濕度35%～55%。

1.5 測定項(xiàng)目與方法

1.5.1 飼料和糞便銅含量的測定

飼料樣品銅含量的測定：參照GB／T 5009.13—2003干灰化法測定。

糞便中銅含量的測定：于第12、19、26和33 d分別從各組中收集糞便并置于恒溫烘箱中烘至恒重，經(jīng)消化試驗(yàn)處理，定容，然后按照GB／T 5009.13—2003干灰化法測定。

1.5.2 血液生化免疫指標(biāo)的測定

觀察并記錄動物的一般表現(xiàn)、行為、中毒癥狀及死亡情況。

血常規(guī)分析：在動物試驗(yàn)期的第12、19、26和33 d,摘除眼球采血，加肝素制備抗凝血進(jìn)行紅細(xì)胞、白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞測定。

免疫指標(biāo)測定：在動物試驗(yàn)期的第12、19、26和33 d,摘除眼球采血，制備血清，采用專用試劑盒測定小鼠胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、小鼠白介素-2（IL-2）及血清免疫蛋白IgG、IgM和IgA。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理后，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相應(yīng)的方差分析和LSD檢驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，以 P＜0.05為顯著水平，P＜0.01為極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同銅源對小鼠銅吸收的影響（見表4）

表4 不同銅源組對小鼠銅排泄量的影響（n=3）（mg/kg排泄物）

由表 4 可知，在小鼠飼養(yǎng)的 6～12、13～19、20～26 d 3個(gè)階段，納米小肽螯合銅組（Ⅵ組）小鼠的銅排泄量均極顯著低于其它各組（P＜0.01），表明在低劑量和正常劑量銅采食量的條件下，納米小肽螯合銅的生物學(xué)效價(jià)最好。在第4階段（27～33 d），由于過量添加銅（15 mg/kg飼料），且小鼠體組織銅沉積是有限的，造成多余的銅大量排出體外。相對而言，納米小肽螯合銅組（Ⅵ組）的銅排泄量除顯著高于Ⅳ組外，極顯著低于其它各組。總體而言，納米小肽螯合銅的生物學(xué)效價(jià)好于其它銅源。

由表4還可看出，蛋氨酸銅組（Ⅳ組）小鼠在6～12 d、20～26 d兩個(gè)階段的銅排泄量僅高于納米小肽螯合銅組，而顯著低于其它各組，而在第27～33 d銅的排泄量極顯著低于其它各組，表明蛋氨酸銅也具有較高的生物學(xué)效價(jià)。無機(jī)銅源包括硫酸銅、堿式氯化銅、納米銅在高劑量（10～15 mg/kg飼料）添加條件下，小鼠的排泄物中銅排泄量較高。

2.2 不同銅源對小鼠血清免疫蛋白IgG、IgM、IgA的影響（見表 5、表 6、表 7）。

由表 5可見，在 6～12 d和 13～19 d，各不同銅源組小鼠的血清IgG隨飼料銅含量由2.5 mg/（kg飼料）增加到5 mg/（kg飼料）而呈提高趨勢，兩個(gè)階段均以納米小肽螯合銅組小鼠的IgG提高極顯著（P＜0.01）。而以蛋氨酸銅和納米銅的增強(qiáng)效果次之。在20～26 d，小鼠的IgG水平各組間差異極顯著（P＜0.01），其中以納米小肽螯合銅組最高，蛋氨酸銅組次之，堿式氯化銅組排在第三位。而對照組、硫酸銅組、納米銅組則較第二階段的IgG水平有下降，表明此銅劑量下不能再提高小鼠的血清IgG水平。在27～33 d，各組飼料銅水平增加到15 mg/（kg飼料），各組小鼠的血清IgG水平與20～26 d階段相比均出現(xiàn)下降，表明超量添加各類銅源，均不能進(jìn)一步提高小鼠血清免疫球蛋白IgG水平，反而可能造成負(fù)面影響。

表5 不同銅源對小鼠IgG的影響（n=3）（μg/ml）

表6 不同銅源對小鼠IgM的影響（n=3）（μg/ml）

表7 不同銅源對小鼠IgA的影響（n=3）（μg/ml）

由表 6可知，在 6～12、13～19 和 20～26 d三個(gè)階段，各不同銅源組小鼠的血清IgM水平隨飼料銅含量增加而提高，各組間差異顯著。而各階段納米小肽螯合銅組小鼠的IgM極顯著（P＜0.01）高于其它各組。蛋氨酸銅對小鼠血清IgM的提高效果次之。在27～33 d，小鼠的血清IgM水平與第三階段相比，除納米小肽螯合銅組略有增加外，其他各組均有下降，表明超量添加各類銅源，均不能進(jìn)一步提高小鼠血清免疫球蛋白IgM水平。

由表7可知，在前三個(gè)飼喂階段，不同銅源組小鼠的血清IgA水平隨飼料銅含量增加而提高。第一階段，納米小肽螯合銅組和蛋氨酸銅組小鼠的IgA水平極顯著（P＜0.01）高于其它各組。在后三個(gè)階段，納米小肽螯合銅組小鼠血清IgA水平極顯著高于其它各組（P＜0.01），蛋氨酸銅組對IgA的提高效果次之，也極顯著高于其他三組。在27～33 d，小鼠的血清IgA水平與第三階段相比均有下降，表明超量添加各類銅源，不能進(jìn)一步提高小鼠血清免疫球蛋白IgA水平。

2.3 不同銅源對小鼠血清中胰島素樣生長因子-1（IGF-1）含量的影響

在450 nm處測OD值，IGF-1濃度與OD值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IGF-1濃度（見圖1）。由回歸系數(shù)r2=0.993 40，通過其二次曲線回歸方程 y=a+bx+cx2（a=16.359 01、b=309.661 74、c=1 275.603 80）獲得檢測樣品IGF-1的濃度見表8。

由表8可知，各飼喂階段小鼠血清中IGF-1的含量在不同銅源組間均存在極顯著差異（P＜0.01）。飼喂納米小肽螯合銅組的小鼠血清中IGF-1含量極顯著高于其它各組（P＜0.01）。總的趨勢是，隨著飼養(yǎng)天數(shù)的增加，小鼠血清中IGF-1含量呈下降趨勢，提高飼料中銅的含量，并不能提高小鼠血清中IGF-1含量。

圖1 IGF-1濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)二次曲線

表8 不同銅源對小鼠血清中IGF-1含量的影響（n=3）（pg/ml）

2.4 不同銅源對小鼠血清中白介素-2（IL-2）含量的影響

在450 nm處測OD值，白介素-2濃度與OD值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IL-2濃度（見圖2）。由回歸系數(shù)r2=0.992 72，通過其二次曲線回歸方程 y=a+bx+cx2（a=44.853 43、b=29.741 78、c=644.881 27）獲得檢測樣品IL-2的濃度見表9。

圖2 白介素-2濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)二次曲線

由表9可知，在整個(gè)飼喂期，納米小肽螯合銅組小鼠血清中的白介素-2極顯著（P＜0.01）高于其它各組。表明納米小肽螯合銅可顯著提高小鼠血清中白介素-2（IL-2）含量。第一和第二階段，飼料中銅的含量由2.5 mg/（kg飼料）提高到正常需要的5 mg/（kg飼料）時(shí)，除第Ⅲ組小鼠血清中的白介素-2水平略有降低外，其余各組小鼠血清中的白介素-2水平均有提高。而在第三階段，飼料中銅的含量提高到10 mg/（kg飼料）時(shí)，各組小鼠血清中的白介素-2水平均較第二階段有所降低，在第四階段，飼料中銅含量達(dá)到15 mg/kg飼料，各組小鼠血清中的白介素-2水平均較第二階段有顯著降低，且Ⅱ組和Ⅲ組、Ⅲ組和Ⅳ組之間差異不顯著。試驗(yàn)表明，小鼠血清中白介素-2水平隨飼喂日齡的增加，先增加后降低，在第20～33 d,超量添加不同來源的銅，不能進(jìn)一步提高小鼠血清中白介素-2水平。

表9 不同銅源對小鼠血清中白介素-2（IL-2）含量的影響（n=3）（pg/ml）

3 討論

3.1 不同銅源對小鼠糞銅排泄量的影響

目前，飼用銅源主要有硫酸銅、堿式氯化銅、氨基酸螯合銅（主要為賴氨酸銅、蛋氨酸銅）、蛋氨酸羥基類似物螯合銅、蛋白水解肽螯合銅。不同銅源對飼養(yǎng)動物的銅吸收利用有一定差異。黃志堅(jiān)等（2007）比較了硫酸銅、煙酸銅和蛋氨酸銅對仔豬銅的生長性能和銅排泄情況，結(jié)果表明，三種銅源對仔豬生產(chǎn)性能的影響無顯著差異，但糞中銅含量，煙酸銅和蛋氨酸銅組比硫酸銅組分別降低了43.7%、45.7%[3]。何河等（2008）[4]的試驗(yàn)結(jié)果也表明，飼喂蛋氨酸銅組仔豬糞中銅排泄量與飼喂硫酸銅組相比顯著降低。D.T.Pal等（2010）[5]對比蛋氨酸銅、蛋氨酸鋅與硫酸銅、硫酸鋅飼喂母羊的效果，在飼喂期第30 d的結(jié)果表明，蛋氨酸銅、鋅顯著提高了母羊肝臟中銅、鋅的含量和銅、鋅超氧化物歧化酶的活性，極顯著降低了糞中銅、鋅的排泄量。本試驗(yàn)中納米小肽螯合銅組斷奶小鼠銅排泄量顯著低于其它各組，表明小肽螯合銅作為一種有機(jī)銅源，可以降低銅的排泄量。而蛋氨酸銅也在第一、三、四階段表現(xiàn)出類似的效果。納米小肽螯合銅表現(xiàn)出獨(dú)特效果的原因，可能是作為多種小肽螯合銅的復(fù)合物較單一氨基酸螯合銅或單一小肽螯合銅更適合動物腸道的吸收和更易于到達(dá)結(jié)合位點(diǎn)而被動物體內(nèi)利用。

3.2 不同銅源對小鼠血清免疫指標(biāo)的影響

不同銅源對小鼠血清免疫指標(biāo)有明顯影響，飼喂第二、三、四階段，納米小肽螯合銅組小鼠的IgG、IgM、IgA 水平極顯著（P＜0.01）高于對照組（Ⅰ組）及其它各組。另外，納米級小肽螯合銅組小鼠的胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及白介素-2（IL-2）水平也顯著好于對照組（Ⅰ組）及其它各組。這表明納米小肽螯合銅有助于小鼠免疫力的提高。隨著小鼠年齡段的增加，小鼠血清中胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及白介素-2（IL-2）含量逐漸降低，這與前人的研究報(bào)道相符合[6-8]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，納米小肽螯合銅與其它銅源相比，可以顯著降低小鼠糞中銅的排泄量，提高小鼠血清中 IgG、IgM、IgA、IGF-1、IL-2的水平。

[1] 李秀霞,許麗,孫協(xié)軍.不同水平銅對小鼠營養(yǎng)與免疫功能的影響[J].四川畜牧獸醫(yī),2004,31（6）:31-32.

[2] 鄧科敏,李前勇,張德志，等.高銅對畜禽養(yǎng)殖及其產(chǎn)品安全的影響 [J].四川畜牧獸醫(yī),2008,35（2）:30-32.

[3] 黃志堅(jiān)，陳強(qiáng)，李清祿，等.不同形態(tài)銅源對仔豬生長性能、血液生化指標(biāo)和糞銅排出量的影響[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，28（1）：32-34.

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Effect of nano copper-small peptide chelate on excretion of copper and immune indexes of mice

Wang Weiguo,Zhang Tianyong

The purpose of this study was to examine influence of the different copper sources include copper sulfate,basic copper chloride,copper-methionine,nano-copper and nano copper-small peptide chelate on copper excretion and key immune indexes of mice.120 18-day-old mice were randomly divided into six treatment groups,Ⅰ（group of small peptide+copper sulfate）,Ⅱ（copper sulfate group）,Ⅲ（basic copper chloride group）,Ⅳ（copper methionine）,Ⅴ（nano-copper group）andⅥ（nano copper-small peptide chelate group）,each treatment group with four duplicates,and each duplicate with five mice.Feeding trial was devided in to five phases from 0～5,6～12,13～19,20～26 and 27～33 d.The 0～5 d phase is the pre-trial period,and all the groups used the same basic diet.In the five trial phases,dietary copper content were supplied with 5,2.5,5,10 and 15 mg per kg feed separately.The results showed that the copper excretion of nano copper-small peptide chelate group is obviously lower than that of other groups （P＜0.05）.During the feeding phases of 2,3 and 4,the levels of IgG,IgM,IgA,IGF-1 and IL-2 in blood serum of mice in the groupⅥwere notablely higher than that of other groups（P＜0.01）.

mouse；nano copper-small peptide chelate；copper exretion；immune index

S816.7

A

1001-991X（2011）07-0011-05

王衛(wèi)國，河南工業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，教授，450001，河南省鄭州市國家高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)蓮花街。

張?zhí)煊拢瑔挝患巴ㄓ嵉刂吠谝蛔髡摺?/p>

2010-12-08

（編輯：劉敏躍，lm-y@tom.com）