2010年上海部分地區440例手足口病病例的病原譜及分子流行病學分析

張曉玲，俞慧菊，余曜，宋志剛，管文彩，馬文藝，胡蕓文

1.上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心，上海 201508； 2.上海交通大學醫學院附屬新華醫院，上海 200092； 3. 中國科學院上海生命科學研究院生物信息中心，上海 200031

手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD) 通常是由腸道病毒引起的兒童急性傳染病，在人口密度較高的亞太地區廣泛流行。臨床癥狀表現為手、足、口腔等部位的斑丘疹、皰疹，少數重癥病例可出現無菌性腦炎、肺炎、肺水腫、心肌炎等，并較快死亡[1]。

引起手足口病的主要病原為腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)和柯薩奇病毒A組16型(coxsackievirus A16, CA16)，其他腸道病毒如腸道病毒A組的CA2、CA4、CA5、CA6、CA8、CA9、CA10，腸道病毒B組的?？刹《?1、4、7型，以及腸道病毒B組3型都可引起手足口病[2]。盡管非EV71非CA16腸道病毒在手足口病病原譜中占一定比例，但目前對其構成和分子流行病學特征尚不清楚。日本、芬蘭等國曾發生由非EV71非CA16腸道病毒引起的手足口病疫情，因此深入了解并日常監測這部分腸道病毒，對手足口病的防治具有重要意義。

本研究在分析2010年來自上海部分地區的440例手足口病病例的病原譜基礎上，對引起手足口病的主要腸道病毒EV71和非EV71非CA16腸道病毒的分子流行病學特征進行了初步探討。

1 材料和方法

1.1 材料

采集上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心、上海交通大學醫學院附屬新華醫院、上海市東方醫院和上海市長寧區中心醫院2010年1～12月的440例手足口病臨床診斷病例共836份標本，其中咽拭子417份、糞便373份、腦脊液46份。診斷依據為衛生部《手足口病診療指南》(2010年版)。在發病早期和抗生素使用前采集標本，采集后暫存于4 ℃冰箱，48 h內冷鏈轉運至上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心并進行處理、分裝，-80 ℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取與反轉錄

用High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche) 試劑盒提取樣本核酸，按試劑盒操作步驟進行。取樣本200 μl，加200 μl含poly(A)的Binding Buffer和50 μl蛋白酶K；72 ℃ 10 min后，用柱子吸附RNA，加入Inhibitor Removal Buffer；再用Wash Buffer洗2次，最后用50 μl Elution Buffer溶解，獲RNA。

用隨機引物和反轉錄酶(TaKaRa Random Primer D3801, PrimeScript Reverse Transcriptase D2680A)反轉錄核酸，按試劑盒操作步驟進行。加入4 μl 5×Buffer、1 μl 10 mmol/L dNTP、1 μl Random Primer和14 μl RNA模板；65 ℃ 15 min后，加入PrimeScript和人胎盤核糖核酸抑制劑(human placental ribonuclease inhibitor, HPRI)各0.5 μl，繼續反應30 ℃ 10 min、42 ℃ 50 min、72 ℃ 10 min，得到cDNA。

1.2.2 腸道病毒通用熒光定量聚合酶鏈反應

所有標本經核酸抽提、反轉錄后，應用腸道病毒通用引物ENVs和ENVas及TaqMan探針ENVprobe進行熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)。該方法參考了Verstrepen等的研究[3]。PCR反應條件：94 ℃ 2 min預變性；94 ℃ 10 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s，5個循環；94 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，42個循環；60 ℃進行熒光檢測。反應在Eppendorf 熒光PCR儀(Realplex 2)上進行，引物和探針序列見表1。

1.2.3 EV71和CA16的PCR檢測

對腸道病毒通用熒光定量PCR檢測陽性的標本，進一步采用衛生部發布的《手足口病預防控制指南》(2008年版)[4]中推薦的特異性分型PCR方法對EV71和CA16進行分型鑒定。其中，檢測EV71的分型引物為EV71s和EV71as，CA16的分型引物為CA16s和CA16as (表1)。PCR反應條件：94 ℃ 2 min預變性；94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，5個循環；94 ℃ 15 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，5個循環；94 ℃ 15 s、45 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，25個循環；72 ℃延伸5 min。反應在PCR儀(Eppendorf)上進行。反應結束后，擴增產物5 μl用2%瓊脂糖凝膠(Biowest agarose regular)電泳，觀察電泳結果(UVItec, UVIpro Sliver)。

表1通用腸道病毒、EV71和CA16的特異性引物和探針

Tab.1Specificprimersandprobesforenterovirus,EV71andCA16

NameSequence (5'-3') PositionENVsCCCTGAATGCGGCTAATCC454-472aENVasATTGTCACCATAAGCAGCCA599-580aEV71sGCAGCCCAAAAGAACTTCAC2366-2385aEV71asATTTCAGCAGCTTGGAGTGC2592-2573aCA16sATTGGTGCTCCCACTACAGC2331-2350bCA16asTCAGTGTTGGCAGCTGTAGG2539-2520bENVprobeAACCGACTACTTTGGGTGT-CCGTGTTTC537-564a

a, according to the strain SHZH03 (GenBank No.: AY465356); b, according to the strain XM-CA16-3560 (GenBank No.: HQ269389).

1.2.4 腸道病毒的反轉錄半套式PCR檢測

對腸道病毒通用熒光定量PCR陽性而EV71和CA16均為陰性的標本，應用反轉錄半套式PCR(reverse transcriptase-seminested PCR，RT-snPCR)檢測。PCR反應條件：第1輪：95 ℃ 30 s、42 ℃30 s、72 ℃ 45 s，40個循環；第2輪：95 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 15 s，40個循環。第2輪PCR產物割膠、回收、純化后送上海博尚生物技術有限公司測序。使用引物見文獻報道[5]。

1.2.5 CA6和CA10的RT-PCR檢測

使用Prime 5軟件，根據GenBank公布的病毒序列自行設計CA6引物(CA6s：5′-GGGGTC-AATGAGGCAGTGT-3′，CA6as：5′-CTGCCATT-GGTATGATTTCCTAC-3′)和CA10引物(5′-CCACTTCTTCTCHCGCTCYGG-3′，5′-GATG-GGTTDGTTGCYGTTTGC-3′)，對RT-snPCR產物測序鑒定為CA6和CA10的陽性標本，使用上述2對引物進行CA6和CA10特異性RT-PCR，與測序鑒定結果完全一致。應用一步法RT-PCR試劑盒(TaKaRa DRR064A)。反應條件：42 ℃反轉錄20 min；95 ℃預變性30 s；95 ℃10 s、56 ℃20 s、72 ℃30 s,40個循環；72 ℃延伸5 min。

1.2.6 一步法RT-PCR擴增EV71 VP1區基因

擴增EV71 VP1全長基因所用引物序列如下。EV71-2312s：5′-AATTACGTGGTTCCAATCGGT-3′，EV71-3385as：5′-TGTGAGTGGCAAGATGT-CGG-3′。應用一步法RT-PCR 試劑盒(TaKaRa 0064A)。反應條件：42 ℃反轉錄20 min; 95 ℃預變性1 min; 95 ℃5 s、55 ℃20 s、72 ℃40 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。

1.2.7 系統發生樹分析

用于建立系統發生樹的核酸序列選自GenBank中腸道病毒各基因型和亞型代表株，以及CA6和CA10的VP1-2A序列，使用ClustalX 2.0比對序列后，采用MEGA4軟件中鄰接法和Kimura 2-parameter模型自舉檢驗且重復1 000次，建立系統發生樹，分析序列進化特點。

2 結果

2010年共收集440例臨床診斷為手足口病的836份標本?；純喊l病年齡0～10歲，平均年齡2.6歲。1～3歲組病例數最多，占70.91%。男性多于女性，其中男性272例、女性168例，男女比例為1.62∶1(表2)。

散居(指分散居住且還沒有進入幼兒園)和幼托患兒共415例，占94.32%。其中散居患兒最多，共318例，占72.27%。

2.1 腸道病毒病原譜的構成

使用腸道病毒通用PCR引物檢測440例手足口病病例，結果腸道病毒陽性病例占88.86%(391/440)，陰性病例占11.14%(49/440)。對391例腸道病毒陽性病例進一步分析各型腸道病毒陽性病例構成比(表2)，發現EV71陽性病例占70.59%(276/391)，CA16陽性病例占12.02%(47/391)，EV71和CA16同時陽性病例占1.28%(5/391)，非EV71非CA16腸道病毒感染病例占16.11%(63/391)。 對非EV71非CA16腸道病毒陽性標本使用RT-snPCR方法擴增基因片段， 并進行DNA測序和序列比對。結果顯示，CA10陽性病例占5.63%(22/391)，CA6占4.09%(16/391)，CA12和CA4各占0.77%(3/391)，CA9、?？刹《?3和?？刹《?各占0.26%(1/391)。為確認上述結果， 使用自行設計的CA6和CA10特異性引物對標本進行驗證，證實RT-snPCR的測序結果與特異性引物檢測結果一致。

表22010年上海440例臨床手足口病病例腸道病毒檢測結果

Tab.2Theenterovirusdetectionof440HFMDcasesinShanghaiin2010

Age(year)HFMD MaleFemaleEV71 positive CA16 positiveEV71/CA16positive Non-EV71/non-CA16 positive Negative casesTotalPercen-tagea0-351221801084710.68%1-92439593151313530.68%2-604260161131210223.18%3-4332471011347517.05%4-23223140464510.23%5-1413190053276.14%6-543003392.05%Total272168276(70.59%b)47(12.02%b)5(1.28%b)63(16.11%b)49440100%

a, percentage of HFMD cases in different age groups; b, percentage of HFMD cases in different enterovirus infection groups.

2.2 病原檢出的月份分布

將440例臨床手足口病病例按月份統計，月份分布見圖1。其中，3～5月64例，6～8月211例，9～11月92例，1～2月和12月合計73例。6、7月病例數達高峰，為166例，占全年收集病例的37.73%(166/440)。EV71為最主要病原體，5～8月出現EV71陽性病例檢出率高峰，陽性病例占5～8月總病例數的69.43%(184/265)，而1～2月和12月陽性病例數占同期總病例數的38.36%(28/73)。CA16陽性病例檢出率僅次于EV71，5～8月CA16陽性病例檢出率為11.70%(31/265)，而1～2月和12月陽性病例檢出率為13.70%(10/73)。1～5月在手足口病病例中未檢測到CA6和CA10陽性病例，而12月CA6和CA10陽性病例達到高峰，分別占全年CA6和CA10陽性病例的87.50%(14/16)和36.36%(8/22)。

2.3 基于EV71 VP1全長基因序列的分子分型

選取16例，擴增標本中EV71的衣殼蛋白VP1全長基因(891個核苷酸，GenBank序列號為JF918563～918578)，對其DNA序列及EV71各基因型和亞型代表株(表3)的序列進行親緣系統發生樹分析。結果顯示，上海地區2010年16例的EV71與C4亞型代表株處于同一分支中，因此屬C4基因亞型。人EV71 C4基因亞型又可分為2個進化分支：C4a 和C4b。本研究中EV71均屬C4a亞型，與國內近年各地流行毒株的核苷酸同源性為94.9%～99.3%(圖2)。

圖12010年EV71、CA16、CA6和CA10陽性病例的月份分布

Fig.1MonthdistributionofpositivecasesinfectedwithEV71,CA16,CA6andCA10in2010

2.4 基于CA6和CA10 VP1序列的系統發生樹

為進一步確認本研究中CA6和CA10的來源，選取GenBank中現有CA6和CA10毒株的VP1基因序列作為建立系統發生樹的參考序列(表3)。

Phylogenetic tree depicting the clustering of selected EV71 isolates based on the 891 nucleotides of VP1 coding region. Sequences of this study are in bold.

圖2EV71系統發生樹

Fig.2PhylogenetictreeforEV71

選取11例的CA6 VP1基因 3′端核苷酸序列(GenBank序列號為JN316013～316023)和GenBank中31株CA6的VP1序列建立系統發生樹，并以CA16病毒株XM/CA16/3560的核酸序列(GenBank序列號為HQ269389)為根序列。結果顯示(圖3)，上海CA6序列與參考株序列一起形成3個主要基因簇：第1個基因簇包括Gdula毒株序列，它與其他CA6序列的同源性為75%～85%；第2個基因簇是來自中國云南的毒株108/YN/2008，它與其他CA6序列的同源性為75%左右；而1999～2008年從日本、芬蘭、新加坡、挪威和中國臺灣地區分離的病毒株與上海11例的CA6序列共同組成第3個基因簇，它們之間同源性高達90%以上。根據bootstrap值，又可將第3個基因簇分為2個亞簇。來自上海10例的CA6序列(“▲”標志)與導致2008年芬蘭手足口病疫情的4株CA6代表株序列以及1株2008年新加坡分離株聚集為亞簇1，它們之間的核苷酸同源性達96%以上。而上海也有1例的CA6分離株(“●”標志)與來自日本、中國臺灣地區、韓國、挪威等的25株CA6代表株序列形成亞簇2，其中與中國臺灣地區2004～2006年的分離株同源性最高，達94%。

表3用于構建EV71、CA6和CA10系統發生樹的核酸序列

Tab.3NucleicacidsequencesusedtoconstructphylogenetictreeforEV71,CA6andCA10

(續表3)

Phylogenetic tree was constructed based on 320 nucleotides from 3′ partial sequences of the CA6 VP1 capsid protein coding region. Sequences of this study are in bold.

圖3CA6系統發生樹

Fig.3PhylogenetictreeforCA6

同樣，選取上海地區21例的CA10 VP1基因 3′端核苷酸序列(GenBank序列號為JN315992～31612)和GenBank中22株CA10的VP1序列建立系統發生樹，以CA16病毒株XM/CA16/3560的核酸序列作為根序列(GenBank序列號為HQ269389)。系統發生樹中有3個主要基因簇(圖4)，呈鮮明的地域分布特征。第1個基因簇是1株美國的CA10流行株Kowalik，與其他地區CA10的同源性只有70%～77%；第2個基因簇主要包括來自芬蘭、德國、拉脫維亞等歐洲國家的7株CA10流行株序列和1株上海分離株序列(“●”標志)，它們之間的同源性達92%～98%，與上海其他20株CA10(“▲”標志)的同源性只有80%。本研究中20株上海CA10毒株和國內近年來流行的CA10毒株共同組成了第3個基因簇，其中上海株與2009年3株山東CA10分離株(WD0002、WD0012、WD0048)和1株2010年云南分離株(16/YN/CHN/2010/CA10)同源性最高，達97%。但2009年以后國內流行株與日本2003年分離株的同源性只有85%左右，與新加坡株的同源性只有78%左右。

Phylogenetic tree was constructed based on 364 nt from 3′ partial nucleotides of the CA6 VP1 capsid protein coding region. Sequences of this study are in bold.

圖4CA10系統發生樹

Fig.4PhylogenetictreeforCA10

2.5 腸道病毒型別與手足口病重癥的關系

440例臨床手足口病病例中，16例為重癥患者，6例死亡。16例重癥患者中，15例感染EV71，1例感染CA16，無1例為CA6或CA10感染。6例死亡者均為EV71陽性。

3 討論

本研究對2010年上海部分地區的440例臨床手足口病病例進行核酸檢測及測序，發現病原體主要為EV71和CA16，其次為CA6和CA10。2005年日本曾報道CA6和CA10的流行[6]。2008年新加坡手足口病暴發期間，檢測到的主要流行病原體為EV71，其次為CA6和CA10，占所有手足口病病例的35.3%[1]。另外，2008年秋季芬蘭暴發的以脫甲癥為臨床特征的手足口病疫情中，CA6和CA10是主要病原體[2]。如今，盡管EV71和CA16已被廣泛認同是導致手足口病流行的主要腸道病毒，但對占有一定比例的非EV71非CA16腸道病毒的構成情況尚不清楚。因此，本研究在總體分析2010年來自上海部分地區的440例臨床手足口病病例腸道病毒譜的基礎上，對引起手足口病的非EV71非CA16腸道病毒的構成及其分子流行病學特征進行了初步探討。

研究發現，440例臨床手足口病病例中，感染EV71和CA16的病例占83%以上，但感染非EV71非CA16腸道病毒的也占16.11%(63/391)，其中以CA10(5.63%，22/391)和CA6(4.09%，16/391)為主，偶見CA12、CA4、CA9、埃可病毒13和?？刹《?。而在2009年4～12月引起北京地區手足口病的非EV71非CA16腸道病毒中，CA10為優勢型別[7]。由此可見，非EV71非CA16腸道病毒的分布存在一定的地域特點。

分析CA6和CA10感染病例的月份分布，發現CA6和CA10占腸道病毒陽性病例的構成比隨季節變化而變化。春季未檢測出CA6和CA10陽性病例，但冬季CA6和CA10卻分別占腸道病毒陽性病例的19.00%和10.96%。2005年日本CA6和CA10流行期在4～7月[6]，2008年芬蘭CA6和CA10流行期為秋季[2]，而2010年上海CA6和CA10流行期主要為秋、冬季。據此推測，上海地區CA6和CA10在秋、冬季可能存在較強的傳播性，在人群中可引起小規模流行。曾有文獻報道，2005年日本手足口病流行期間，CA6和CA10傳播性比EV71強，但毒力比EV71弱[6]。CA6和CA10在流行時間和毒力方面與EV71存在的差異可能與生物學特性不同有關，值得進一步研究。

EV71系統發生樹結果顯示，2010年上海部分地區流行的EV71屬C4a基因亞型，與近年來中國其他省市流行的EV71毒株高度同源，提示上海地區流行株來源于國內流行株。1999年至今，中國各地多次暴發的手足口病疫情均由C4基因型引起，包括2008年中國安徽省阜陽市流行的手足口病[8]、2009年山東省菏澤市集中暴發的手足口病等[9]，提示EV71 C4亞型在我國廣泛分布和流行。

基于CA6 VP1基因序列的系統發生樹顯示，上海地區CA6序列和參考株序列一起形成了3個主要基因簇，其中第3個基因簇又分為2個亞簇。2008年芬蘭分離的4株CA6代表株序列和本研究中上海病例的CA6(“▲”標志)序列聚集于亞簇1，同源性達96%以上，提示2010年上海流行的CA6毒株與2008年芬蘭手足口病疫情的CA6毒株可能存在一定的進化關系。

基于CA10 VP1基因序列的系統發生樹顯示，近年來國內流行毒株主要聚集于第3個基因簇中，具有很高的同源性；其他東亞地區、國家之間的CA10進化有較明顯的差異；而歐洲幾個國家的毒株序列則聚集于另一基因簇。提示目前國際上CA10流行株具有高度的地域分布特征，歐亞大陸各自流行的毒株在分子進化上有一定差異。本研究中20例上海病例的CA10病毒序列與3株2009年山東代表株和1株2010年云南代表株同源性很高，說明上海地區流行的CA10毒株可能來源于國內同期的流行株。值得注意的是，上海有1例病例的CA10(“●”標志SHAPHC798F/SH/CHN/2010)序列與芬蘭、德國和拉脫維亞的代表株序列聚集在一起，提示此病例感染的CA10可能與歐洲部分地區流行株有一定的關聯。

結合臨床資料分析發現，導致本研究中22例手足口病重癥和死亡的主要病原體是EV71，僅1例重癥為CA16感染；而CA6和CA10陽性病例的臨床癥狀較輕，無重癥或死亡發生，提示不同腸道病毒感染導致的手足口病臨床轉歸可能不同。由于本研究涉及的非EV71非CA16感染病例較少，不同腸道病毒感染引起的手足口病臨床特征仍需進一步探討。

由于GenBank中收錄的CA6和CA10序列較少，尚不能準確定位本研究中上海病例的CA6和CA10基因亞型，因此也無法進一步推測其亞型變化的流行趨勢。鑒于本研究中CA6和CA10感染病例數隨月份而增加的趨勢，推斷其在冬季感染人群的能力較強，傳播較快，且近年來報道CA6和CA10流行的文獻陸續出現，提醒人們需加強對CA6和CA10的監測工作，并深入研究其生物學特性和分子流行病學特征，為手足口病的預測、預警和防治工作提供科技支撐。

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