乙型肝炎病毒e抗原的生物學功能及血清學轉(zhuǎn)換的免疫學基礎

聞玉梅

復旦大學上海醫(yī)學院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室，上海 200032

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因組的讀碼框架共編碼4類抗原蛋白，即包膜抗原〔HBV表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)包括S區(qū)編碼的小s抗原、PreS2/S編碼的中s抗原、PreS1/PreS2/S區(qū)編碼的大s抗原〕、核心抗原(hepatitis B virus core antigen, HBcAg)、x抗原(hepatitis B virus x antigen，HBxAg)及可分泌的e抗原(hepatitis B virus e antigen，HBeAg)。HBeAg是PreC/C基因編碼，經(jīng)修飾后可在細胞內(nèi)存在并分泌至細胞外，可從感染者血清中測及的一種HBV抗原標志。HBeAg早在1972年由Magnius與Espmark發(fā)現(xiàn)并報道[1]。他們應用瓊脂雙擴散方法檢測不同HBsAg(當時為Australian Antigen)陽性者血清時，發(fā)現(xiàn)除a、d、r等血清型外，額外出現(xiàn)一條沉淀帶，命名為e抗原。隨后Hoofnagle等[2,3]發(fā)現(xiàn)HBeAg與肝炎相關，而HBeAg消失后出現(xiàn)抗HBe則與肝功能恢復相關，從而奠定了檢測HBeAg及抗HBe的臨床意義。

1 HBeAg的分子生物學研究

隨著對HBV基因組研究的深入，以及用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分析HBeAg的分子結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)現(xiàn)HBV PreC基因編碼肽段將C基因編碼多肽轉(zhuǎn)至細胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，經(jīng)修飾后導致HBeAg分泌[4]。HBV PreC mRNA編碼的PreC/C蛋白約212個氨基酸(相對分子質(zhì)量為25×103，稱P25)。這一蛋白經(jīng)過2次修飾，首先氨基端19個氨基酸作為信號肽將PreC/C蛋白轉(zhuǎn)位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，隨即該肽被信號肽酶切除，成為P22，即在PreC端仍保留10個氨基酸；然后羧基端約30個氨基酸可能在高爾基復合體中被去除，從而獲得一個成熟的HBeAg，其相對分子質(zhì)量為16×103～17×103(P16～17)，由149或154個氨基酸組成[5]。雖然HBeAg大部分氨基酸與HBcAg氨基酸序列相同，但兩種蛋白的折疊形式不同，因此生物學特性也不同。HBeAg是可分泌的可溶性蛋白，而HBcAg可聚合成核心顆粒，從而適合于將前基因組包裝在其中，并開始基因組的復制。核心顆粒聚合依賴的是2個C蛋白各自61位半胱氨酸形成的二硫鍵。C蛋白以羧基端富有堿性精氨酸的部分與帶負電荷的前基因組RNA相互作用而包裹病毒核酸。由于HBeAg PreC殘留末端的-7位半胱氨酸(以羧基端的第1位氨基酸計算)能與自身61位半胱氨酸(Cys-7-Cys61)形成二硫鍵，因此無法如C蛋白那樣形成二聚體并最終組成核心顆粒；加上HBeAg羧基端缺少富含精氨酸的部分，不能形成二聚體，也不能與核酸結(jié)合，因此HBeAg的功能與HBcAg完全不同。雖然HBcAg與HBeAg在高級結(jié)構(gòu)(蛋白構(gòu)型)有很多不同，但HBcAg第80位氨基酸左右的構(gòu)型與HBeAg第80位氨基酸左右的構(gòu)型還是相同的。因此，用變性的HBcAg免疫獲得的多克隆抗體只能用于蛋白免疫印跡法識別HBeAg(因2種蛋白的相對分子質(zhì)量不同)，而不能用于其他血清學反應。如果用于臨床檢測，還需用不同的抗體檢測不同的抗原。

2 HBeAg的生物學及醫(yī)學意義

2.1 HBeAg的功能

最早臨床醫(yī)學家發(fā)現(xiàn)HBeAg與肝炎進展相關，而抗HBe出現(xiàn)往往是病情好轉(zhuǎn)的跡象。隨后發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象主要在北歐及北美患者中存在，而在地中海、非洲和東亞地區(qū)有少部分患者雖然HBeAg陰性、抗HBe陽性，但持續(xù)低度的血清HBV DNA陽性(103～105copies/ml)，肝臟炎癥反應依然持續(xù)[6]。有學者認為這些炎癥反應表現(xiàn)為肝內(nèi)點狀壞死病變，可能是因自身免疫所致[7]。另有學者認為，HBeAg陰性/抗HBe陽性患者血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)正常>12個月為非活動性攜帶組，而ALT>1.5倍正常上限應與HBeAg陽性一樣列為活動性肝病組。經(jīng)過長期隨訪發(fā)現(xiàn)，在亞洲血清HBV DNA<300 copies/ml患者發(fā)生肝癌的概率僅為HBV DNA>105copies/ml患者的1/10(前者為1.30%，后者為14.89%)。因此，如血清HBV DNA>103copies/ml或104copies/ml，即使HBeAg陰性/抗HBe陽性也應進一步治療，以防止肝癌的發(fā)生[9]。

1989年，Carman等首次報道慢性乙型肝炎患者血清中存在PreC區(qū)1 896位核苷酸由G向A的點突變，導致該區(qū)出現(xiàn)終止密碼子，致不表達HBeAg[10]。當時認為這一突變僅限于重癥肝炎患者，但以后發(fā)現(xiàn)這一突變在不同病情、不同種族患者中均存在[11]。此外，在基礎核心啟動子區(qū)(basal core promoter，BCP)發(fā)現(xiàn)，各種突變可致HBeAg表達下降，其中T1762A和G1764A雙突變最為常見。這些突變株可表現(xiàn)為HBeAg陰性或低度HBeAg陽性。屠紅于1997年通過斑點雜交法快速檢測我國446份乙型肝炎患者血清，研究抗HBe陽性患者中出現(xiàn)PreC終止密碼子的突變情況。發(fā)現(xiàn)上海47.4%、成都75.0%、武漢78.9%，而海口僅17.6%。標本中相當一部分患者中突變株與野生株共存[12]。上述結(jié)果說明，早在20世紀我國抗HBe陽性乙型肝炎患者中已含有一定比例的HBeAg陰性毒株。這些毒株可能在抗HBe的免疫壓力下，又未能及時被抗病毒藥物抑制，逐漸增多，在準種中占上風，而可能成為主流毒株。

圖1 HBeAg造成免疫耐受及引起免疫應答的機制示意圖Fig.1 Schematic plot of mechanism of immune tolerance and immune response caused by HBeAg

2.2 HBeAg在母嬰傳播中受到廣泛重視

如圖1所示，一般認為HBeAg或其衍生肽可能通過胎盤而抑制甚至清除胎兒體內(nèi)HBeAg特異的T輔助細胞(T helper cell，Th細胞)。但是到一定年齡或在一定條件下，通過骨髓及胸腺的補充，或通過免疫調(diào)控治療，HBeAg特異的Th細胞有可能恢復功能。這就是某些患者可自發(fā)出現(xiàn)HBeAg血清學轉(zhuǎn)換，或經(jīng)過治療獲得HBeAg血清學轉(zhuǎn)換的機制。HBsAg和HBeAg雙陽性母親娩出的嬰兒如不以疫苗免疫阻斷，嬰兒HBV感染概率曾被高估為90%[8]。目前主張對HBsAg和HBeAg雙陽性母親娩出的嬰兒，應采用HBV疫苗加乙型肝炎免疫球蛋白進行主動與被動免疫，有效降低嬰兒HBV感染率。現(xiàn)已明確，HBsAg和HBeAg雙陽性母親娩出的嬰兒易感染HBV與這類孕婦血清中HBV滴度高有關。有研究顯示，在產(chǎn)前3個月用核苷類藥物抑制孕婦血清中HBV DNA可有效降低嬰兒HBV感染率。但孕婦分娩后是否應繼續(xù)抗病毒治療、是否適宜哺乳等，仍需進一步研究。

2.3 HBeAg調(diào)控免疫的功能

HBeAg和HBcAg Th細胞表位的識別是相互交叉的，而HBeAg因其相對分子質(zhì)量小，能以完整HBeAg形式或衍生肽經(jīng)胎盤進入胎內(nèi)。又由于HBeAg陽性孕婦娩出的嬰兒HBV感染率高，因此學者們重點研究了HBeAg是否為一種導致免疫耐受的耐受原。Milich等用HBeAg陽性轉(zhuǎn)基因鼠研究HBeAg的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)血清中的HBeAg可選擇性致HBeAg和HBcAg特異性Th1細胞缺失或低下，有利于HBV的持續(xù)存在[13]。其后，Chen等進一步報道，在TCRXHBc/HBeAg雙重及多重轉(zhuǎn)基因鼠中，血清表達HBeAg阻止HBcAg的血清學轉(zhuǎn)換，即不出現(xiàn)抗HBc。結(jié)果顯示，HBeAg可能作為T細胞的耐受原而調(diào)控胞內(nèi)HBcAg的免疫應答[14]。

近年來，學者們研究了HBeAg調(diào)控天然免疫的作用，發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性乙型肝炎患者的外周血白細胞和肝臟細胞的Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR-2)表達下降，并對多種TLR配體的應答下降。將正常人外周血細胞與HBeAg共孵育后再用TLR-2和TLR-4配體刺激，產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)明顯降低，提示可抑制重要的炎癥應答因子[15]。最近Lang等報道，HBeAg可影響Toll樣/白細胞介素1受體(Toll/interleukin 1 receptor，TIR)與TLR的相互作用，從而可特異抑制TIR介導的一些促炎癥反應轉(zhuǎn)錄因子，如核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)與β干擾素(interferon β，IFN-β)的啟動子[16]。這些研究揭示了HBeAg可調(diào)控天然免疫，從而與發(fā)病及病毒持續(xù)相關。

3 HBeAg血清學轉(zhuǎn)換的免疫學基礎

在臨床治療乙型肝炎中，HBeAg的血清學轉(zhuǎn)換(血清中HBeAg消失，出現(xiàn)抗HBe)已作為一項重要指標。究其原因，是HBeAg血清學轉(zhuǎn)換反映機體免疫功能的改善，而血清HBV DNA水平僅代表病毒被抑制、復制水平下降。

3.1 HBcAg與HBeAg誘生的Th細胞類型

為研究HBcAg和HBeAg在誘生體液免疫及細胞免疫方面有無不同，Milich曾用2種不同免疫原分別免疫小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBcAg免疫并不需要佐劑，可誘導IgG2a和 IgG2b亞類抗HBc，無IgG1或IgG3抗體。相反，HBeAg需加佐劑免疫，并誘生IgG1亞類抗體及低效價IgG2a/IgG2b抗體。在細胞因子方面，HBcAg的Th細胞主要產(chǎn)生IL-2和IFN-γ，而HBe免疫后主要誘生IL-4。結(jié)果證明，2種抗原雖然在Th細胞識別的氨基酸一級結(jié)構(gòu)上有大部分相同并有交叉，但分別誘生的Th細胞則根據(jù)2種抗原性的不同而誘生不同類型的應答[17]。研究者在急、慢性乙型肝炎患者中還發(fā)現(xiàn)，HBcAg和HBeAg共有的CD4+T細胞表位主要在1～25和61～85位氨基酸，其他如21～45、41～65、81～105位氨基酸也具有免疫表位作用，并認為HBcAg和HBeAg特異的CD4+T細胞與清除病毒相關[18]。

3.2 HBcAg與HBeAg的免疫原性比較

為研究HBcAg和HBeAg的特異免疫原性，Milich分別研究了2種重組抗原在pH 7.2與pH 9.6條件下的不同穩(wěn)定性。HBcAg在2種pH值時均穩(wěn)定。在pH 9.6時，HBeAg只表現(xiàn)HBeAg的特異抗原性；在pH 7.2時，則同時表達HBcAg和HBeAg的抗原性。由此可利用不同pH條件下的HBeAg來分別研究兩者的免疫原性。用pH 7.2的HBeAg(HBeAg 7.2)或pH 9.6的HBeAg(HBeAg 9.6)分別免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)HBcAg的免疫原性顯著高于HBeAg 7.2或HBeAg 9.6。在去胸腺小鼠中發(fā)現(xiàn)，HBcAg可在無Th細胞條件下直接激活B細胞產(chǎn)生抗體，而HBeAg(pH 9.6)在裸鼠中不能誘生抗HBe，反映HBeAg必須依賴Th細胞才能產(chǎn)生抗體，因此HBcAg是T細胞依賴性及非T細胞依賴性抗原，而HBeAg是T細胞依賴性抗原(表1、2)。此外，用這2種抗原免疫獲得的單克隆抗體相互無交叉抑制應答，顯示 HBcAg與HBeAg誘生抗體的表位不同。

表1HBcAg與HBeAg的免疫原性比較

Tab.1ComparisonofimmunogenicitybetweenHBcAgandHBeAg

FeatureHBcAgHBeAgLocalizationCytosolicSecreted/cytosolicCytotoxic T lymphocyte target+Cross-reactive with HBeAg+ CytosolicAntibody responseHigh (non-cross-reactive with HBeAg)(TI/TD)Comparatively low (TD)T proliferationHigh (cross-reactive with HBeAg)LowTh subsetTh1-likeTh2/Th1-likeImmunoregulation-+ Neonatal tolerance-+ Cross regulates HBcAgAntigen presentation via Ag-MHC class II pathway-+

表2裸鼠的實驗結(jié)果

Tab.2Studiesinnudemice[19]

StrainImmunogen4 μgTime(days)Antibody titeranti-HBcanti-HBeBalb/c (nu/nu)HBcAg71/10 2400141/20 4800Balb/c (nu/nu)HBeAg 71/10 2400(pH 7.2)141/10 2400Balb/c (nu/nu)HBeAg 700(pH 9.6)1400

Anti-HBc and anti-HBe were determined by solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

3.3 HBeAg血清學轉(zhuǎn)換的意義

迄今為止，人們認為慢性乙型肝炎患者恢復的最關鍵環(huán)節(jié)是提高特異性細胞免疫(CD4+與CD8+細胞)及天然免疫(自然殺傷細胞、巨噬細胞、細胞因子等)。HBV表達的HBsAg和HBeAg都是T細胞依賴性抗原，而HBcAg因可組成顆粒性結(jié)構(gòu)，是T細胞依賴性及非T細胞依賴性抗原。因此，乙型肝炎患者雖然細胞免疫低下，體內(nèi)可出現(xiàn)抗HBc，但很少出現(xiàn)抗HBe或抗HBs。臨床病程中當患者HBeAg陰轉(zhuǎn)的同時出現(xiàn)抗HBe則顯示機體的細胞免疫有所好轉(zhuǎn)。目前，多數(shù)治療乙型肝炎的制品均以HBeAg血清學轉(zhuǎn)換為療效終點。本實驗室進行的復合物型治療性疫苗的臨床研究也以HBeAg血清學轉(zhuǎn)換為治療終點[19,20]。當患者血清中HBsAg消失并出現(xiàn)抗HBs，則反映機體的免疫功能顯著好轉(zhuǎn)或治愈。HBeAg血清學轉(zhuǎn)換雖然有可能發(fā)展至HBsAg血清學轉(zhuǎn)換，但也有患者可因免疫功能降低而再度轉(zhuǎn)為抗HBe陰性，HBeAg轉(zhuǎn)陽。單獨HBeAg消失而未出現(xiàn)抗HBe，可能是因為HBV被抑制而致相應分泌蛋白降低或消失，主要反映病毒被抑制,并不能反映免疫功能好轉(zhuǎn)。在部分乙型肝炎患者中，可因PreC或C啟動子區(qū)有突變而致HBeAg陰轉(zhuǎn)或下降，從而轉(zhuǎn)為HBeAg陰性肝炎。因此，在出現(xiàn)HBeAg血清學轉(zhuǎn)換時，應同時檢測血清HBV DNA是否下降(<103copies/ml)及ALT是否恢復正常，以全面考核療效。

4 結(jié)語

綜上所述，HBeAg的功能與特點總結(jié)如下：①HBeAg是具有耐受原與免疫原雙重作用的可分泌性蛋白。②HBcAg比HBeAg免疫原性強，因B細胞更易于呈遞顆粒性核心抗原的表位。③分泌型HBeAg造成免疫耐受可致HBcAg特異Th1細胞型應答缺失，或轉(zhuǎn)為Th2細胞型應答。HBcAg的細胞免疫主要為Th1細胞型，而HBeAg主要為Th1/2細胞型。HBeAg可致Th1細胞凋亡，交叉調(diào)控對HBcAg的Th細胞應答。④PreC蛋白可調(diào)控HBeAg。⑤內(nèi)源性表達的HBeAg經(jīng)加工及主要組織相容復合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子呈遞，方可激活HBcAg/HBeAg CD4+細胞，并可能引起細胞殺傷，而胞內(nèi)HBcAg無此功能。⑥HBeAg可作用于天然免疫，如TLR-2、TLR-4和TLR-7(有爭論)。⑦HBeAg的耐受可自然消失或被免疫調(diào)控后逆轉(zhuǎn)。抗HBe的出現(xiàn)需要T細胞協(xié)同。因此，HBeAg消失、抗HBe出現(xiàn)反映機體T細胞功能有所改善。

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