中國漢賽巴爾通體分離株的多位點(diǎn)序列分型分析＊

趙 帆,宋秀平,栗冬梅,黃儒婷,李志芳,3,劉起勇

中國漢賽巴爾通體分離株的多位點(diǎn)序列分型分析＊

趙 帆1,宋秀平1,栗冬梅1,黃儒婷2,李志芳1,3,劉起勇1

目的 了解中國漢賽巴爾通體的遺傳背景和流行的常見亞型。方法對(duì)分離到的漢賽巴爾通體應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型方法(multilocus sequence typing,MLST),分析它們的分子流行病學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育情況。結(jié)果80株漢賽巴爾通體一共分為3個(gè)序列型(sequence type,ST),其中ST1占90%(72/80),ST9占8.75%(7/80),另一個(gè)序列型為僅包含一株細(xì)菌的ST30;所有3個(gè)序列型均屬于克隆群1(clonal comp lex 1)。結(jié)論與國外漢賽巴爾通體多位點(diǎn)序列分型結(jié)果相比,中國的序列型相對(duì)集中,說明中國漢賽巴爾通體的變異度和多樣性較低,提示其進(jìn)化相對(duì)緩慢。

漢賽巴爾通體;多位點(diǎn)序列分型;序列型;克隆群

漢賽巴爾通體(Bartonella henselae)是巴爾通體屬(Bartonella)中一種重要的人獸共患病病原,為革蘭氏染色陰性的需氧桿菌,其培養(yǎng)條件苛刻,分離難度很大。感染漢賽巴爾通體后,根據(jù)人體的免疫狀況不同,身體會(huì)有不同的疾病反應(yīng):在免疫功能正常的患者中,漢賽巴爾通體主要引起貓抓病(cat scratch disease,CSD)[1-3],而免疫受損患者感染之后則可引起桿菌性血管瘤(bacillary angiomatosis)[4-5]、桿菌性紫癜(bacillary peliosis)[6-7]、培養(yǎng)陰性的心內(nèi)膜炎[8]、視神經(jīng)病變等嚴(yán)重疾病[9]。

由于病原菌的亞型往往與其致病的能力種類相關(guān),在進(jìn)行細(xì)菌致病的風(fēng)險(xiǎn)因素評(píng)估時(shí)考慮亞型與疾病的相關(guān)性,可以作出更切合實(shí)際的預(yù)防措施。而目前常用的16S rDNA分型方法僅能將漢賽巴爾通體分成2個(gè)亞型,并且兩種都對(duì)人類致病[10-11],這促使研究者們選擇更敏感的方法對(duì)漢賽巴爾通體進(jìn)行分型。多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)由 M aiden等研究設(shè)計(jì),于 1998年首先應(yīng)用于自然變異的腦膜炎奈色球菌(N eisseria meningitides)[12],后來被廣泛應(yīng)用于其他病原菌、環(huán)境菌和真核生物中。與傳統(tǒng)分子生物學(xué)分型方法相比,MLST具有更高的分辨力,能將同種細(xì)菌分為更多的亞型,并確定之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及與疾病的聯(lián)系[13],因而成為更有前景的檢測和分型方法。2003年,MLST由 Iredell引入到漢賽巴爾通體的分型中[14],經(jīng)A rvand優(yōu)化后被廣泛接受[15]。多年以來,各國研究者們使用MLST方法對(duì)漢賽巴爾通體進(jìn)行了大量的分析,結(jié)果顯示該方法能夠較為合理地分析菌株間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。為進(jìn)一步了解中國的漢賽巴爾通體菌株的分子流行病學(xué)背景,我們對(duì)近幾年分離到的漢賽巴爾通體進(jìn)行了MLST基因分型,并分析了各序列型間的遺傳關(guān)系及其與國外分離株間的聯(lián)系。

1 材料與方法

菌株來源及培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用菌株為本科室自2005年至2010年間從采集到的家貓、家犬和人的全血中分離且經(jīng)過鑒定的漢賽巴爾通體,共計(jì)80株。具體信息見表1。其中,78株貓?jiān)礉h賽巴爾通體分離自北京市、河南省和山東省三個(gè)地區(qū),一株犬源漢賽巴爾通體分離自北京,一株人源漢賽巴爾通體分離自山東。菌株的分離培養(yǎng)和復(fù)蘇全部用含5%的無纖維新鮮羊全血瓊脂糖培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇漢賽巴爾通體標(biāo)準(zhǔn)株 Houston-1[CIP 103737,G5436](A TCC 49882)為參考菌株。

表1 漢賽巴爾通體分離株基本信息Table 1 General information of B.henselae isolates in this study

1.2 MLST分析

1.2.1 基因組DNA的提取 復(fù)蘇保存于-80℃超低溫冰箱中的漢賽巴爾通體分離菌株,傳代一次后收集純培養(yǎng)的細(xì)菌菌體,使用 Qiagen公司的DNAeasy試劑盒提取全菌基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)中選用的8個(gè)管家基因,即 16S rDNA、batR、g ltA、f tsZ、gro EL、nlpD、ribC和rpoB,以及提供的引物序列合成8對(duì)擴(kuò)增引物[14](表2)。引物的擴(kuò)增條件使用標(biāo)準(zhǔn)菌株優(yōu)化之后,應(yīng)用于分離菌株的DNA模板,所有擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶再進(jìn)行DNA序列分析。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成,測序工作由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

表2 MLST中所用8個(gè)管家基因及其擴(kuò)增片段大小和引物情況Table 2 Primers used for am plification and sequencing of 8 housekeeping genes for B.hensela e MLST scheme

1.2.3 MLST結(jié)果分析 將8個(gè)管家基因片段的測序結(jié)果與NCB I中對(duì)應(yīng)基因的所有等位基因型進(jìn)行比較,分別確定每個(gè)分離株的等位基因編號(hào),按照文獻(xiàn)提供的順序?qū)⒏鞯任换蛱?hào)依次排列獲得每個(gè)分離株的等位基因譜,并確定各自的序列型。搜集國內(nèi)外目前已經(jīng)發(fā)表的所有序列型,應(yīng)用eBURST程序分析中國漢賽巴爾通體分離株的序列型在克隆群(clonal comp lex)中的位置,應(yīng)用M ega 4.0軟件中鄰接法 (neighbor-joining,NJ)基于核苷酸Kimura 2-parameter模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 使用雙側(cè) Fisher’s精確檢驗(yàn)分析各序列型在分離地點(diǎn)間的差異,P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 MLST結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的MLST基因片段電泳圖譜 在優(yōu)化的擴(kuò)增條件下,用標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶,如圖1所示。8對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物片段范圍在300-500 bp之間,且經(jīng)測序后比對(duì)完全與網(wǎng)上發(fā)布序列一致,為ST1,沒有出現(xiàn)因?yàn)閭鞔驍U(kuò)增引起的突變。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 Houston-1的8個(gè)管家基因片段擴(kuò)增結(jié)果電泳Fig.1 Electrophoresis for amplified products of eight housekeeping genes from reference strain Houston-1 M:marker;con:negative control;PCR product for housekeeping fragments were show n as indicated

2.1.2 分離株的M LST結(jié)果 經(jīng)過8對(duì)引物擴(kuò)增和測序比對(duì)之后,80株分離株被分成3種序列型(ST1,ST9,ST30),其中72株為 ST1,占檢測菌株的90%,在三個(gè)分離地點(diǎn)均有分布,包括唯一的犬源分離株和人源分離株;7株為ST9,占檢測菌株的8.75%,全部為分離自北京的貓?jiān)礉h賽巴爾通體;剩下的一株是新發(fā)現(xiàn)的序列型ST30,分離自山東省家貓,其管家基因 rpoB序列為首次報(bào)道的等位基因型6(allele 6),已經(jīng)注冊到美國國立衛(wèi)生院的NCB I網(wǎng)站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上,登錄號(hào)為GU 477585.1,序列型ST30的等位基因譜信息也已注冊到 MLST網(wǎng)站(www.m lst.net),可以在漢賽巴爾通體子數(shù)據(jù)庫中找到。比較3種不同序列型菌株的地理分布(表3),發(fā)現(xiàn)ST1和ST9菌株的分離地點(diǎn)之間有顯著性差異(P<0.05),而ST30因?yàn)槠浯砭陻?shù)太少,所以其地理分布不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 MLST序列型的系統(tǒng)進(jìn)化分析 根據(jù)MLST網(wǎng)站信息和文獻(xiàn)報(bào)道,將已有的30種序列型及其等位基因譜(表4)錄入eBRUST程序,分析各序列型間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,結(jié)果如圖2所示,一共得到4個(gè)克隆群;A rvand M報(bào)道的獨(dú)特性ST7[15]因?yàn)楦嘈蛄行偷陌l(fā)現(xiàn)成為一個(gè)新的克隆群。分析中國目前分離株序列型間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)序列型ST1、ST9和ST30聚集于克隆群1,其中,ST1和ST30親緣性較近而與ST9相距較遠(yuǎn)。但是英國、德國、法國、意大利等歐洲國家分離得到了包括克隆群1～4在內(nèi)的幾乎所有序列型,與之相比,中國的漢賽巴爾通體序列型則單一而集中,種內(nèi)多樣性較低。

表3 MLST分析結(jié)果Table 3 MLST analysis result

8個(gè)管家基因的擴(kuò)增片段按照相同順序頭尾相接串聯(lián)形成一條新序列,將所有序列型各自串聯(lián)得到的新序列用M ega 4.0軟件的 neighbo r-joining(NJ)算法分析(圖3)。所有序列型在NJ樹狀圖中得到展現(xiàn),從總體上顯示出各序列型間的關(guān)系。其中,克隆群1所在分支經(jīng) bootstrap分析可信度為76%,說明聚集在該群中的序列型親緣性相近,來源于同一個(gè)祖先的可能性較大;另外一個(gè)可信度為91%的分支,包含了克隆群4的所有序列型。而在eBURST結(jié)果中分屬兩個(gè)不同的克隆群(克隆群2和3)的序列型,在NJ樹中卻聚到一起,不過此分支的可信度不足50%,是否能被認(rèn)可還需要更多數(shù)據(jù)的支持。

圖2 eBURST分析各漢賽巴爾通體序列型間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationship between different B.henselae STsas determ ined by eBURST

表4 30個(gè)序列型信息Table 4 Profiles for 30 STs

圖3 基于漢賽巴爾通體各序列型的串聯(lián)序列構(gòu)建的 NJ樹(顯示經(jīng)bootstrap 1000分析可信度高于50%的節(jié)點(diǎn))Fig.3 Neighbor-joining tree of the concatenated sequences of B.henselae STs(value of boostrap 1000 analysisgreater than 50%was shown)

3 討 論

自2003年MLST應(yīng)用于漢賽巴爾通體的分子分型研究以來,各國的相關(guān)研究工作陸續(xù)發(fā)表。Iredell從37株漢賽巴爾通體分離株中得到了7種序列型[14],幾年之后,A rvand分析了收集自歐洲、美國和澳大利亞的182株漢賽巴爾通體,將序列型擴(kuò)展到了14種[15]。2010年德國研究者新發(fā)現(xiàn)11種序列型[16],隨后英國又發(fā)現(xiàn)了多個(gè)新的序列型而將總數(shù)增加到29。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),序列型ST7僅局限于歐洲,ST1、ST5、ST6和 ST8呈世界性分布,但是其中ST5、ST6和ST8常見于歐洲,而 ST1正好相反,在歐洲的分離率較低。提示各序列型有一定的地理分布特點(diǎn)。

本文首次報(bào)道了中國漢賽巴爾通體分離株的MLST分析結(jié)果。從80株漢賽巴爾通體分離株中我們得到3種序列型(表3),其中世界性分布的序列型ST1占90%。說明漢賽巴爾通體ST1是中國的流行型,且呈廣泛流行趨勢。另外兩種序列型分別占此次分析菌株的8.75%和1.25%,提示中國漢賽巴爾通體分離株序列型單一而集中、種內(nèi)變異率低。結(jié)合 Yanagihara報(bào)道的數(shù)據(jù)[17],日本國內(nèi)55株漢賽巴爾通體經(jīng)MLST分析分為三種序列型,94.5%(52/55)的菌株為ST1,其余3株分屬兩個(gè)序列型,進(jìn)一步提示漢賽巴爾通體在亞洲地區(qū)進(jìn)化保守,群體中流行型別單一。

通過系統(tǒng)發(fā)育分析我們發(fā)現(xiàn),中國漢賽巴爾通體的3種序列型均屬于克隆群1,雖然ST9與ST1和ST30在克隆群中有一定距離(圖2),但總體上該分支所包含的序列型還是屬于親緣性較高的一群漢賽巴爾通體,其bootstrap 1000分析可信度為76%,說明中國的漢賽巴爾通體雖然發(fā)生了少量變異,但是其變異僅在克隆群內(nèi)部發(fā)生,主流序列型為ST1,菌株相對(duì)保守和集中,提示漢賽巴爾通體在中國的宿主群中可能尚未發(fā)生大規(guī)模的變異事件。

由于漢賽巴爾通體的研究在中國還屬于初級(jí)階段,可供參考的資料不多。并且臨床醫(yī)生對(duì)漢賽巴爾通體所致疾病不熟悉,臨床報(bào)道僅限于部分醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)而少有實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。本文利用近年來從宿主(主要為家貓)中分離到的漢賽巴爾通體菌株,分析其多位點(diǎn)序列分型結(jié)果,發(fā)現(xiàn)中國家貓中漢賽巴爾通體的流行型ST1,是已被廣泛報(bào)道的致病亞型,并且在家犬和人血中分離到的菌株也屬相同的序列型,提示中國存在漢賽巴爾通體感染的危險(xiǎn)因素,其感染狀況可能被嚴(yán)重忽視,人群中的漢賽巴爾通體流行型有待進(jìn)一步研究核實(shí)。

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Multilocus sequence typing analysis for Bartonella henselae isolates in China

ZHAO Fan,SONG Xiu-ping,L IDong-mei,HUANG Ru-ting,L IZhi-fang,L IU Qi-yong

(State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China)

To understand the genetic background and epidemiological subtype of Bartonella henselae isolates in China,multilocus sequence typing method was used to analyzed the molecular epidemiological characteristic and phylogenetic relationship for B.henselae.Results showed that 80 B.henselae isolates were belonged to three sequence types(STs).90%isolates was ST1(72/80)and 8.75%was ST9(7/80),whileonly one strain was belonged to a new type ST-ST30.In addition,all the three STs were belonged to clonal complex 1.Compared with the other reports on B.henselae MLST analysis,the STs were centralized in China,suggesting low diversity and evolution speed among B.henselae isolates in China.

Bartonella henselae;multilocus sequence typing;sequence type;clonal comp lex

R181.2

A

1002-2694(2011)07-0592-05

＊重要病媒生物監(jiān)測和傳播相關(guān)病原體檢測技術(shù)研究(2008ZX10004-010);傳染病防治科技重大專項(xiàng)“傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺(tái)”細(xì)菌性傳染病病原體流行規(guī)律及變異研究(2009ZX10004-203)

劉起勇,Email:liuqiyong@icdc.cn

1.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所媒介生物控制室,傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206;2.北京市豐臺(tái)區(qū)疾病預(yù)防控制中心,北京 100071;3.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室,鄭州 450001

2011-01-16;

2011-04-24