RP-HPLC法測(cè)定注射用甲磺酸加貝酯中有關(guān)物質(zhì)的含量

袁利杰，楊本霞，陳 杰，鄭子棟

（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州市 450003）

RP-HPLC法測(cè)定注射用甲磺酸加貝酯中有關(guān)物質(zhì)的含量

袁利杰＊，楊本霞，陳 杰，鄭子棟

（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州市 450003）

目的：建立測(cè)定注射用甲磺酸加貝酯中有關(guān)物質(zhì)含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Agilent C18，流動(dòng)相為甲醇-混合緩沖鹽溶液（pH 5.2）-異丙醇（382∶152∶8），流速為1.0mL·min－1，柱溫為30℃，采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)，已知雜質(zhì)羥苯乙酯檢測(cè)波長(zhǎng)為258nm，其他未知雜質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)為236nm。結(jié)果：在選定的色譜條件下，主成分與有關(guān)物質(zhì)能完全分離，羥苯乙酯檢測(cè)濃度線性范圍為0.0149～9.90μg·mL－1（r＝0.9995），平均回收率為99.4%，RSD＝0.5%。3批樣品中羥苯乙酯含量分別為0.22%、0.21%、0.24%；其他有關(guān)物質(zhì)分別為0.31%、0.20%、0.24%。結(jié)論：該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，可用于注射用甲磺酸加貝酯中有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。

注射用甲磺酸加貝酯；有關(guān)物質(zhì)；羥苯乙酯；反相高效液相色譜法；含量測(cè)定

甲磺酸加貝酯（GM）是20世紀(jì)70年代日本研制的一種非肽類蛋白酶抑制劑，具有分子量小、無(wú)免疫原性的特點(diǎn)，可抑制胰蛋白酶、激肽釋放酶、纖維蛋白溶酶、凝血酶等蛋白酶的活性，從而抑制這些酶所導(dǎo)致的病理生理變化[1～3]。目前對(duì)GM原料的有關(guān)物質(zhì)研究較多，其中有國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1（X-237）-2004Z，其采用含量測(cè)定項(xiàng)下方法對(duì)已知雜質(zhì)“羥苯乙酯”進(jìn)行檢查；鄭朝華等[4]用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定其有關(guān)物質(zhì)。對(duì)注射用GM的方法研究有局版標(biāo)準(zhǔn)WS1（X-323）-2004Z，但該標(biāo)準(zhǔn)中未收載“有關(guān)物質(zhì)”檢查項(xiàng)。由于GM在水中不穩(wěn)定，易水解成對(duì)羥基苯甲酸乙酯（簡(jiǎn)稱羥苯乙酯），羥苯乙酯量大時(shí)易引起不良反應(yīng)[5]。為控制其質(zhì)量，筆者采用RP-HPLC法測(cè)定其中有關(guān)物質(zhì)的含量，其中有關(guān)物質(zhì)包括已知雜質(zhì)羥苯乙酯和其他未知雜質(zhì)。在本文中，采用對(duì)照品法測(cè)定羥苯乙酯的量，采用自身對(duì)照法測(cè)定其他雜質(zhì)的量。結(jié)果表明，此法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，可用于注射用GM中有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

2695 HPLC儀、2996型二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）。

羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100847-200501，純度：100%）；注射用GM（某某公司，批號(hào)：20091101、20091102、20091201，規(guī)格：每支0.1g）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-混合緩沖鹽溶液（取無(wú)水醋酸鈉0.6g、十二烷基硫酸鈉0.1g、庚烷磺酸鈉0.1g，加水152mL溶解，用稀醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.2）-異丙醇（382∶152∶8）；溶劑：甲磺酸甲醇溶液（0.48%甲烷磺酸溶液2mL加甲醇至1000mL）；流速：1.0mL·min－1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按GM計(jì)為4135。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取羥苯乙酯、注射用GM和空白輔料分別加入溶劑制備成溶液，于二極管陣列檢測(cè)器中在210～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，從色譜中提取羥苯乙酯和甲磺酸加貝酯的光譜，可知羥苯乙酯在258nm波長(zhǎng)處有最大吸收，甲磺酸加貝酯在236nm波長(zhǎng)處有最大吸收，空白輔料在該范圍內(nèi)無(wú)吸收。所以本試驗(yàn)采用雙波長(zhǎng)控制雜質(zhì)的含量，羥苯乙酯檢測(cè)波長(zhǎng)定為258nm，其他未知雜質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)定為236nm。光譜見圖1。

2.3 空白輔料試驗(yàn)

取處方比例混合的空白輔料適量，加溶劑制成每1mL約含1mg的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10μL，結(jié)果輔料在236、258nm的2個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下均不干擾GM中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，詳見圖2。

2.4 羥苯乙酯檢出限、定量限和線性關(guān)系

稱取羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品適量，用溶劑溶解并制成濃度為0.4952mg·mL－1的母液，再逐級(jí)稀釋為所需的不同濃度的溶液，按上述色譜條件，波長(zhǎng)為258nm時(shí)，分別進(jìn)樣10μL。當(dāng)信噪比（S/N）為3∶1時(shí)，測(cè)得羥苯乙酯的檢出限為0.0495ng；當(dāng)信噪比（S/N）為10∶1時(shí)，測(cè)得羥苯乙酯的定量限為0.149ng。

圖1 二極管陣列檢測(cè)器光譜圖a.羥苯乙酯；b.注射用GM；c.空白輔料Fig1 Spectrograms of diode array detectora.ethylparaben；b.gabexate mesylate for injection；c.blank excipients

圖2 不同波長(zhǎng)下空白輔料高效液相色譜圖Fig2 HPLC chromatograms of blank excipients at different detection wavelength

取羥苯乙酯濃度分別為 0.0149、0.0743、0.248、0.495、0.990、2.97、4.95、7.43、9.90μg·mL－1（相當(dāng)于雜質(zhì)限度的200%）的溶液，進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積A，以溶液濃度（c）為橫坐標(biāo)，以A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程：A＝66042c+5366.9（r＝0.9995），表明羥苯乙酯檢測(cè)濃度線性范圍為0.0149～9.90μg·mL－1。

2.5 羥苯乙酯精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取羥苯乙酯濃度為4.952μg·mL－1的溶液，連續(xù)進(jìn)樣7次，測(cè)定其峰面積，計(jì)算，得其RSD＝0.5%（n＝7），表明本法的精密度良好。用上述同樣的溶液，每隔1h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算，得其RSD＝0.6%（n＝8），表明該溶液在8h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 羥苯乙酯回收率試驗(yàn)

稱取供試品適量，加溶劑制成濃度為4.978mg·mL－1的溶液，分別精密量取10mL，置于4個(gè)50mL容量瓶中；再分別量取羥苯乙酯濃度為24.62μg·mL－1的溶液3、5、15mL分別置于3個(gè)50mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度。另取溶劑為對(duì)照，進(jìn)樣。在波長(zhǎng)為258nm時(shí)，每個(gè)樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算（對(duì)照液中羥苯乙酯的量為0.2305%），結(jié)果平均回收率為99.4%（RSD＝0.9%），詳見表1。

2.7 方法的專屬性

取供試品適量，進(jìn)行不同條件下的降解試驗(yàn)，試驗(yàn)條件依次為：（1）樣品未經(jīng)破壞；（2）高溫破壞：樣品在105℃條件下放置20min；（3）氧化破壞：加入30%的過(guò)氧化氫溶液0.1mL，室溫放置10min；（4）酸破壞：加入0.1mol·L－1鹽酸溶液5mL，搖勻，室溫下放置5min后用堿中和；（5）堿破壞：加入0.1mol·L－1氫氧化鈉溶液5mL，搖勻，立即用酸中和；（6）光照破壞：在強(qiáng)光下照射1d。6種條件下的樣品均用甲磺酸甲醇溶液稀釋制成濃度為1mg·mL－1溶液，搖勻，進(jìn)樣10μL。結(jié)果，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為236nm時(shí)，測(cè)得產(chǎn)生的降解物質(zhì)與主峰的分離度均大于1.5，能完全分離，表明該法的專屬性較強(qiáng)；選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為258nm時(shí)，測(cè)定結(jié)果顯示5種破壞后羥苯乙酯的量均有所增加，尤以酸、堿破壞后增加明顯。色譜見圖3。

表1 羥苯乙酯回收率測(cè)定結(jié)果Tab1 Results of recovery test of ethylparaben

圖3 高效液相色譜圖A.未經(jīng)破壞樣品；B.高溫破壞后樣品；C.氧化破壞后樣品；D.酸破壞后樣品；E.堿破壞后樣品；F.光照破壞后樣品；I.羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品；1.GM；2.羥苯乙酯Fig3 HPLC chromatogramsA.non-destroyed sample；B.samples destroyed by high temperature；C.samples destroyed by oxidation；D.samples destroyed by acid；E.samples destroyed by alkali；F.samples destroyed by light；I.standard of ethylparaben；1.GM；2.ethylparaben

2.8 GM檢出限、精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品適量，加溶劑溶解并稀釋成濃度為0.292μg·mL－1的溶液，搖勻，在波長(zhǎng)為236nm時(shí)分別進(jìn)樣20、10、5、2、1μL，當(dāng)信噪比（S/N）為3∶1，測(cè)得GM的檢出限為0.58ng。取GM濃度為0.3mg·mL－1的溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，計(jì)算，得其RSD＝0.4%（n＝6），表明本法的精密度良好；再每隔1h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，共8h，計(jì)算，得其RSD＝0.5%（n＝8），表明該溶液在8h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 樣品中羥苯乙酯和其他有關(guān)物質(zhì)的含量測(cè)定

取供試品適量，加溶劑制成濃度為1mg·mL－1的溶液作為供試品溶液；另稀釋成濃度為0.01mg·mL－1的溶液作為對(duì)照液；取羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品適量，加溶劑制成濃度5μg·mL－1的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照上述色譜條件，記錄供試品溶液色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2.5倍。當(dāng)波長(zhǎng)為258nm時(shí)以外標(biāo)法計(jì)算羥苯乙酯的量，結(jié)果3批分別為0.22%、0.21%、0.24%，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定含羥苯乙酯的量不得過(guò)0.5%，表明3批樣品均符合規(guī)定；當(dāng)波長(zhǎng)為236nm時(shí)以自身對(duì)照法計(jì)算除羥苯乙酯峰和溶劑峰外其他有關(guān)物質(zhì)的量，結(jié)果3批分別為0.31%、0.20%、0.24%，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定除羥苯乙酯峰和溶劑峰外其他有關(guān)物質(zhì)的量不得過(guò)1.0%，表明3批樣品均符合規(guī)定。

3 討論

從不同降解條件下提取除羥苯乙酯外其他所有降解雜質(zhì)的光譜圖，顯示大部分降解雜質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)均接近GM的最大吸收波長(zhǎng)236nm，所以試驗(yàn)中采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)法以控制不同雜質(zhì)的含量，對(duì)已知雜質(zhì)羥苯乙酯其檢測(cè)波長(zhǎng)確定為258nm，其他雜質(zhì)測(cè)定波長(zhǎng)為236nm。

筆者對(duì)本法的流動(dòng)相也進(jìn)行了考察，在保證良好的柱效和分離度的前提下，選擇流動(dòng)相的酸度更接近中性，有利于延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命；另外，不同條件下的降解試驗(yàn)表明，注射用GM對(duì)稀堿溶液極不穩(wěn)定，對(duì)酸也有一定程度的不穩(wěn)定，故樣品在貯藏、運(yùn)輸、使用過(guò)程中，應(yīng)注意酸、堿對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

由以上試驗(yàn)可知本法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、精密度好，能夠有效控制注射用GM中的羥苯乙酯和其他有關(guān)物質(zhì)的含量，建議新版注射用GM標(biāo)準(zhǔn)中增加有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，以更好地控制藥品的質(zhì)量。

[1] 房建和，何笑蓉，田淑霞.加貝酯的藥理與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)新藥雜志，1995，4（6）：12.

[2] Cortesi R，Ascenzi P，Colasanti M，et al.Cross-enzymeinhibition by gabexate mesylate：formulation and reactivity study[J].J Pharm Sci，1998，87（11）：1335.

[3] 彭國(guó)林，李兆申.加貝酯防治急性胰腺炎應(yīng)用現(xiàn)狀[J].胰腺病學(xué)，2005，5（3）：177.

[4] 鄭朝華，崔 京，陳玉英.反相離子對(duì)高效液相色譜法分離甲磺酸加貝酯有關(guān)物質(zhì)及其含量測(cè)定[J].藥物生物技術(shù)，2005，12（1）：36.

[5] 朱全剛，胡晉紅，孫華君，等.3種內(nèi)服液體制劑中羥苯甲酯和羥苯乙酯的含量測(cè)定[J].中國(guó)藥房，2002，13（9）：553.

Content Determination of Related Substances in Gabexate Mesylate for Injection by RP-HPLC

YUAN Li-jie，YANG Ben-xia，CHEN Jie，ZHENG Zi-dong
（He’nan Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of related substances in Gabexate mesylate for injection.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent C18column with mobile phase consisted of methanol-mixed buffer solution（pH 5.2）-isopropanol（382∶152∶8）at flow rate of 1.0mL·min－1.The column temperature was set at 30℃.The detection wavelength of ethylparaben was set at 258nm and the detection wavelength of other impurities was set at 236nm.RESULTS：Related substances were completely separated from the main constituent.The linear range of ethylparaben was 0.0149～9.90μg·mL－1（r＝0.9995）with average recovery of 99.4%（RSD＝0.5%）.The contents of ethylparaben in 3batches of samples were 0.22%，0.21%and 0.24%and the contents of other related substances were 0.31%，0.20%and 0.24%，respectively.CONCLUSION：The method is sensitive and specific for the quality control of Gabexate mesylate for injection.

Gabexate mesylate for injection；Related substances；Ethylparaben；RP-HPLC；Content determination

R927.11；R982

A

1001-0408（2011）17-1611-03

＊主管藥師，碩士。研究方向：化學(xué)藥品分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：yuanlij@126.com

2010-07-22

2010-09-21）

·新藥與輔料·