胸腺五肽脂質體的研制

裴斐，宋宏新，張鳳龍，趙金禮

（1.陜西科技大學生命科學與工程學院，西安市 710021；2.陜西九州生物科技股份有限公司，西安市 710075）

胸腺五肽脂質體的研制

裴斐1＊，宋宏新1#，張鳳龍2，趙金禮2

（1.陜西科技大學生命科學與工程學院，西安市 710021；2.陜西九州生物科技股份有限公司，西安市 710075）

目的：制備胸腺五肽脂質體并進行質量評價。方法：采用復乳法制備胸腺五肽脂質體，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）及卵磷脂為成球材料、以胸腺五肽為主藥制備脂質體。以明膠濃度、PLGA濃度和卵磷脂濃度為考察因素，以包封率和載藥量為考察指標設計L9（34）正交試驗優化基質處方并進行驗證試驗。通過測定優化處方所制脂質體粒徑、包封率、體外累積釋放百分率等評價脂質體質量。結果：優化基質處方為明膠、PLGA和卵磷脂濃度分別為100、200、100mg·mL－1。所制脂質體形態完整，平均粒徑為（9.03±0.83）μm，載藥量與包封率分別為（1.81±0.03）%與（74.4±1.4）%，20d的累積釋藥百分率達90%以上。結論：所制胸腺五肽脂質體工藝簡單、重現性好，包封率和載藥量高，具有顯著的緩釋作用。

胸腺五肽；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；脂質體；制備；優化基質處方；正交試驗；質量評價

胸腺五肽（Thymopentin，TP-5）系胸腺生成素Ⅱ第32～36位的多肽片斷（即精-賴-天冬-纈-酪氨酸），為胸腺生成素Ⅱ的免疫活性中心，能增進機體免疫力[1]。主要用于治療特應性皮炎、慢性淋巴細胞性白血病、慢性乙型肝炎、各種原發性或繼發性T細胞缺陷疾病、某些自身免疫性疾病、各種細胞免疫功能低下的疾病以及腫瘤的輔助治療。臨床上常用的劑型為注射用凍干滅菌粉末。但是，TP-5在人血漿中很快由蛋白酶和氨肽酶降解為氨基酸，半衰期約為30s[2]，需頻繁注射給藥，患者依從性差。因此，開發其長效注射劑是國內外長期研究的方向。

為此，筆者以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）及大豆卵磷脂為載體，采用復乳法制備TP-5脂質體。該法是在TP-5微球的基礎上進行改良的，即在PLGA外層再次用卵磷脂進行包裹，去掉了微球制備工藝中離心、水洗和凍干等操作，直接用橄欖油將脂質體混懸分散后低溫保存，大大簡化了制備工藝。所制備脂質體設計的藥物含量約20mg·mL－1，包封率和載藥量也較理想，為開發TP-5脂質體新劑型奠定了初步基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KS-150超聲波細胞粉碎機（寧波科生儀器廠）；AC135精密電子天平（瑞士梅特勒公司）；85-1磁力攪拌器（上海浦東物理光學儀器廠）；XS-212光學顯微鏡（南京江南光電股份有限公司）；高效液相色譜（HPLC）系統，包括1525梯度泵、2996PDA紫外檢測器、EMPOWER色譜工作站（美國Waters公司）。

1.2 試藥

TP-5（陜安九州生物科技股份有限公司合成，批號：20091126，純度：＞99%）；PLGA（山東省醫療器械研究所，Mr＝15000，LA∶GA＝50∶50）；聚乙烯醇、明膠（天津市科密歐化學試劑有限公司）；大豆卵磷脂（上海東尚實業有限公司，注射級）；膽固醇（上海化學試劑站分裝廠，批號：950517）；其他試劑均為市售色譜純或分析純。

2 方法與結果

2.1 TP-5脂質體的制備

采用改進的復乳法制備TP-5脂質體[3]。將40mg TP-5溶解于100μL明膠水溶液作為內水相，PLGA加入3mL二氯甲烷反復振蕩充分溶解后作為油相，將內水相加入油相在90W的功率下超聲乳化10s得W/O1初乳，在磁力攪拌機攪拌條件下將初乳倒入10mL含大豆卵磷脂和膽固醇的二氯甲烷溶液中（卵磷脂與膽固醇質量比為2∶1），經過高速攪拌2min得到W/O1/O2復乳，室溫條件下（25℃）繼續緩慢攪拌10h，充分揮發二氯甲烷并固化脂質體后，加入10mL橄欖油繼續攪拌10h將其分散置于4℃環境保存。

影響復乳法制備脂質體因素繁多，在預試驗基礎上確定對TP-5脂質體的制備和性質影響較顯著的3個因素，即明膠濃度（A）、PLGA濃度（B）、卵磷脂濃度（C），單因素確定每一因素的3個水平（濃度），按L9（34）正交表設計試驗。考察每組試驗的包封率（Encapsulation efficiency）和載藥量（Drug loading），并按正交試驗結果得出的最優制備工藝條件，重復試驗3次，考察脂質體制備工藝的重現性。因素水平見表1。

表1 因素水平表Tab1 Factors and levels

2.2 脂質體載藥量、包封率的測定

2.2.1 TP-5色譜條件及線性范圍。以0.01mol·L－1的磷酸鹽緩沖液（pH＝7.4）為溶劑，制備質量濃度為50、100、200、300、400、500mg·L－1的TP-5標準溶液，采用HPLC法測定。色譜條件：色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.60mm，5μm），柱溫：25℃，檢測波長：215nm，流動相：15%乙腈（含0.1%三氟乙酸），流速：1.0mL·min－1，進樣量：20μL。計算得TP-5質量濃度（c）和峰面積（A）的線性回歸方程：A＝1437.2c－6159.6（R2＝0.9998，n＝6），檢測濃度線性范圍為50～500mg·L－1。

2.2.2 精密度試驗[4]。以0.01mol·L－1的磷酸鹽緩沖液（pH＝7.4）為溶劑精密制備低、中、高（50、200、500mg·L－1）3種濃度的TP-5標準溶液，在“2.2.1”色譜條件下測定，同日重復測定5次，隔日測定1次，共測5d。結果低、中、高3種濃度的日內RSD分別為1.37%、0.98%和1.95%（n＝5），日間RSD分別為1.45%、1.89%和1.27%（n＝5）。

2.2.3 回收率試驗。以0.01mol·L－1的磷酸鹽緩沖液（pH＝7.4）為溶劑精密制備低、中、高（50、200、500mg·L－1）3種濃度的TP-5標準溶液，取按照優化條件制備的空白脂質體9份，各100mg，精密加入各濃度的TP-5標準溶液100μL，低、中、高3種濃度各3份，加蒸餾水定容到1mL，充分振蕩后10000r·min－1離心10min。取上層清液作為樣品溶液，膜過濾后按“2.2.1”色譜條件下測定。結果低、中、高3種濃度的回收率分別為99.47%、100.26%和99.86%，RSD分別為0.65%、0.89%和1.21%。

2.2.4 TP-5載藥量、包封率的測定。準確稱取TP-5脂質體100mg加蒸餾水定容到1mL，充分振蕩后10000r·min－1離心10min。取上層清液作為樣品溶液，膜過濾后按照“2.2.1”條件采用HPLC法測定TP-5含量。將測量結果代入載藥量、包封率的公式進行計算：

2.3 處方優化試驗方案及結果

對于脂質體來說，包封率（X）和載藥量（X′）都是極其重要的指標，前者可衡量制劑在臨床應用中的可行性，后者代表制劑工藝的可行性。兩者同等重要，因此權重系數均設為0.5，其綜合評分可由以下公式計算：Y＝50×（Xi/Xmax）+50×（Xi′/X′max）。

制備TP-5脂質體的正交試驗結果見表2，方差分析結果詳見表3。

表2 正交試驗結果Tab2 Results of orthogonal experiments

表3 方差分析結果Tab3 Analysis of variance

由試驗結果的直觀分析和方差分析結果可知：PLGA濃度（因素B）對脂質體的包封率影響最大，其次為卵磷脂濃度（因素C），明膠濃度（因素A）影響最小，最佳脂質體制備工藝為A2B2C2（即明膠濃度100mg·mL－1、PLGA濃度200mg·mL－1和卵磷脂濃度100mg·mL－1。

2.4 質量評價

2.4.1 TP-5脂質體的平均粒徑、載藥量與包封率。按照優化后的處方和工藝條件制備3批TP-5脂質體，測定其平均粒徑、載藥量和包封率。平均粒徑測定方法：取制備好的TP-5脂質體用水混懸后，置于載玻片上，用顯微鏡觀察粒子的形態，并用顯微鏡測微尺測定粒徑大小，結果見表4。

表4 3批TP-5脂質體的平均粒徑、載藥量與包封率測定結果Tab4 Mean particle size，drug loading capacity and encapsulation coefficiency of 3batches of thymopentin liposome

2.4.2 形態觀察。取其中1批置于光學顯微鏡下觀察形態，結果脂質體表面光滑圓整，球體均勻度較好，詳見圖1。

圖1 TP-5脂質體光學顯微鏡下形態（×400）Fig1 Photomicrograph of thymopentin liposome（×400）

2.4.3 TP-5脂質體體外釋藥性能。對3批按照優化條件制備的TP-5脂質體進行體外釋藥考察。考慮到試驗所用溶出量較少，故在選擇溶出檢測方法時，排除了大容量的籃法和槳法，而選用小杯法。每批精密稱取含藥脂質體100mg各7份分別置于小杯內，以0.01mol·L－1磷酸鹽緩沖液50mL（pH＝7.4、含0.02%疊氮鈉作為抑菌劑）為溶出介質，在100r·min－1轉速、（37±0.5）℃條件下進行脂質體的體外釋放度測定。分別在1、2、3、7、10、15、20d時取出1個小杯。從中取5mL溶液，2000r·min－1離心 10min，吸取上層清液，膜過濾后按照“2.2.1”條件測定TP-5含量。根據已知脂質體載藥量及TP-5的釋放量計算各時間點的累積釋藥百分率，繪制脂質體的體外累積釋藥曲線，詳見圖2。

由圖2可看出，TP-5脂質體具有明顯的緩釋作用，首日突釋小于20%，其后藥物釋放速度比較穩定，20d的累積釋藥百分率在90%以上。

3 討論

本文使用的脂質體制備方法為自行研究首創，是在微球制備方法的工藝上進行改進的。傳統的微球制備方法只采用PLGA一種材料包裹藥物[5]，認為所制備微球未包裹的藥物分為2部分，一部分游離在溶劑體系中，另一部分則依附于PLGA表面。而本文中脂質體制備工藝在PLGA包裹TP-5完成后再用卵磷脂進行二次包裹，這樣可以將微球表面的TP-5也包裹進去，因此比微球制備工藝包封率得到了提高；同時最外層用橄欖油而不是水來分散脂質體，避免了TP-5向外水相的擴散，因此制得的TP-5脂質體具有較高的包封率和載藥量。

圖2 3批TP-5脂質體的體外釋藥曲線Fig2 Release curves of 3batches of thymopentin liposome in vitro

綜上所述，所制胸腺五肽工藝簡單、重現性好，包封率和載藥量高，具有顯著的緩釋作用。

本文所制備TP-5脂質體可采用皮下包埋的給藥途徑，市售TP-5注射液用法用量為每次1mg，每日1～2次。筆者下一步將進行動物實驗以考察所制TP-5脂質體給藥量及其體內釋藥規律和釋藥動力學，并進一步對脂質體在體內與體外釋藥的相關性進行考察和比較，以及進行藥效學研究，以便對TP-5新藥劑型的研發提供參考。

（注：本實驗是在陜西九州生物科技股份有限公司多肽實驗室完成）

[1] Gonser S，Weber E，Folkers G.Peptides and polypeptides as modulators of the immune response：thymopentin——an example with unknown mode of action[J].Pharm Acta Helv，1999，73（6）：265.

[2] Tischio JP，Patrick JE，Weintraub HS，et al.Short in vitro halflife of thymopoietin 32-36pentapep tide in human plasma[J].Int J Peptide Protein Res，1979，14（5）：479.

[3] [英]V.P.托爾欽林，V.魏西希主編.鄧意輝，徐 暉譯.脂質體[M].北京：化學工業出版社，2007：3-8.

[4] 胡展紅，石 琦，張學農.去甲斑蝥素脂質體的制備工藝優化及其藥劑學性質研究[J].中國藥房，2009，20（4）：279.

[5][英]J.西尼爾，M.拉多米斯基主編.鄭俊民譯.可注射緩釋制劑[M].北京：化學工業出版社，2005：98-103.

Study and Preparation of Thymopentin Liposomes

PEI Fei，SONG Hong-xin
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China）
ZHANG Feng-long，ZHAO Jin-li
（Shaanxi Jiuzhou Biotechnology Co.，Ltd.，Xi’an 710075，China）

OBJECTIVE：To prepare thymopentin liposomes and to evaluate the quality of it.METHODS：Thymopentin liposomes were prepared by double emulsion process using poly（lactic-co-glycolic acid）（PLGA）and lecithin as carrier and thymopentin as main components.The preparation method was optimized by orthogonal experiment L9（34）using the concentration of gelatin，PLGA and lecithin as factors and with encapsulation coefficency and drug loading capacity as index.The particle size，encapsulation coefficency and in vitro accumulative release rate of liposomes were determined to evaluate the quality of it.RESULTS：The concentrations of gelatin，PLGA and lecithin in optimal base formula were 100mg·mL－1，200mg·mL－1，100mg·mL－1，respecetively.Prepared liposomes were complete in shape with mean particle size of（9.03±0.83）μm.The drug loading capacity and encapsulation coefficiency were（1.81±0.03）%and（74.4±1.4）%.Accumulative release rate was more than 90%in 20days.CONCLUSION：Preparation technology is simple and reproducible.Prepared thymopentin liposomes have high drug loading capacity and encapsulation coefficiency，and sustained-release effect.

Thymopentin；Poly（lactic-co-glycolic acid）；Liposomes；Preparation；Optimal base formula；Orthogonal experiment；Quality evaluation

R943；R977.4；R979.5

A

1001-0408（2011）17-1595-03

＊碩士研究生。研究方向：藥物新劑型。E-mail：p03570311@163.com

#通訊作者：教授，碩士研究生導師。研究方向：生化制藥。E-mail：hongxinsong@163.com

2010-07-12

2010-08-31）