長角血蜱感染漢賽巴爾通體后血淋巴超氧化物歧化酶變化的初步研究＊

李志芳,劉起勇,張衛東,宋秀平,栗冬梅,馬懷雷,趙 帆,孟鳳霞,任東升,靳建超,林 杰,吳海霞

長角血蜱感染漢賽巴爾通體后血淋巴超氧化物歧化酶變化的初步研究＊

李志芳1,2,劉起勇2,張衛東1,宋秀平2,栗冬梅2,馬懷雷2,趙 帆2,孟鳳霞2,任東升2,靳建超2,林 杰2,吳海霞2

目的 測定長角血蜱(Haemaphysalis longicornis)感染漢賽巴爾通體(Bartonella henselae)后不同時間段超氧化物歧化酶的活性。方法用 Hamilton 10μL微量進液器將漢賽巴爾通體菌液懸浮液(濃度為105cfu/μL),通過假頭與盾板間緣凹處注入已部分吸血的未交配的長角血蜱成蜱血腔內,在染毒后1 h,6 h,12 h,24 h及48 h后收集長角血蜱的血淋巴,使用南京建成超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒測定其血淋巴中SOD的活性。同時設立生理鹽水對照組,對比兩組之間及兩組內各時間點是否存在差異。結果對收集到的不同時間段的血淋巴測定超氧化物岐化酶的活性后發現,實驗組在感染后48 h內,酶活性一直處在平穩的水平;生理鹽水對照組SOD酶活性隨著時間的延長先升高后又降低,在12 h達到(11.1999±1.3248)U/mL,并且與實驗組此時間段的酶活性相比有統計學差異(P=0.036);而在48 h降為最低,與1 h的酶活性相比有統計學差異(P=0.000)。結論長角血蜱受到一定濃度的漢賽巴爾通體攻擊后,血淋巴SOD酶活性在一段時間內受到了抑制。

漢賽巴爾通體;長角血蜱;超氧化物歧化酶

巴爾通體(Bartonella)由秘魯細菌學家A lberto Barton,1909年首次從O roya熱病人的紅細胞中發現,它是一種革蘭染色陰性,營養條件要求苛刻,兼性細胞內寄生的需氧桿菌,與一類新發的人獸共患性疾病密切相關。其中漢賽巴爾通體(B.henselae)是目前已知的致病種類最多的巴爾通體[1],引起的最常見的疾病如貓抓病(cat scratch disease,CSD)等。巴爾通體可以通過吸血節肢動物如蚤[2]等叮咬而引起人獸共患病。蜱類是專性吸血的節肢動物,可以傳播多種病原體,如伯氏疏螺旋體,森林腦炎病毒等[3]。目前有很多報道顯示在蜱中也檢測到了巴爾通體[4-5],而對于巴爾通體血清學陽性的人或動物大部分有蜱類叮咬的病史[6-8],雖然現在有很多媒介生物學家和流行病學家都認為蜱在巴爾通體的傳播過程中發揮著很大的作用[9],但究竟蜱能否傳播巴爾通體?哪些蜱種可以傳播巴爾通體?其機制如何?本實驗就長角血蜱在受到漢賽巴爾通體的攻擊之后體內防御酶活性的變化進行研究,希望可以從免疫學的角度為蜱類傳播巴爾通體提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗用蜱 實驗室飼養的長角血蜱(Haem aphysalis longicornis),同一代次,雌性成蜱,并由同一雌蜱產卵孵化而成,隨機抽取20%,PCR檢測不含漢賽巴爾通體。所需的長角血蜱均是在 ICR小鼠上吸血飼養,ICR小鼠為清潔動物,按照20%的比例隨機抽取并經 PCR檢測不含漢賽巴爾通體。實驗所用蜱為吸血5～6 d未進行交配過的雌性成蜱。

1.2 菌液懸浮液的配制 漢賽巴爾通體A TCC○R49882(Houston-1),購自美國標準生物制品收藏公司(A TCC)。復蘇及傳代時,均混合營養肉湯涂布于含5%去纖維羊血的胰酶大豆瓊脂培養基上,在含5%CO2,37℃的培養箱中生長,傳代至3～4代,生長5～6 d時使用。首先用無菌接種環從胰酶大豆瓊脂培養基上刮取適量的漢賽巴爾通體,用無菌生理鹽水在常溫下離心洗滌2遍(5 000×g,10 min),然后使用比濁儀 (Densimat,Biomérieux SA France.)測定濁度,并進行稀釋,使最后菌液的濃度為1×105cfu/μL。

1.3 長角血蜱的感染 試驗分2組,實驗組(生理鹽水+漢賽巴爾通體組)以及生理鹽水對照組(簡稱對照組)。實驗組和對照組各設立3個平行對照。首先準備一塊干凈的載玻片,用雙面膠粘在正中央,放在顯微鏡下。取出一只飼養5～6 d呈半飽血的長角血蜱,放在雙面膠上,使其背部朝上。用鑷子輕壓蜱的頭部,使用10μL的 Hamilton注射器及33G針頭,將已配制好的菌液懸浮液(實驗組)或無菌生理鹽水(對照組)通過假頭與盾板間緣凹處注入已部分吸血的未交配的成蜱血腔內[10],每只注射5μL。

1.4 采集血淋巴 根據王平等[11]的方法采集血淋巴。在感染后不同時間(1 h、6 h、12 h、24 h和48 h)用眼科剪切斷雌蜱附肢基部,定量毛細管收集血淋巴后,迅速打入預冷的緩沖液(1%肝素鈉,PBS(p H7.4),PMSF(100 mmol/L)及少量的苯基硫脲)中,-20℃保存備用。

1.5 SOD活性測定 將采集得到的血淋巴隔夜放置,次日于4℃,3 000r/min,離心15 min,取上清作為受試樣品。測定步驟按照南京建成SOD測試盒的步驟進行,確定最佳取樣量,使用7230G型可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司),在550 nm波長處讀取吸光度(A)值,測定總SOD活力。

2 結 果

2.1 不同時間段實驗組與對照組SOD酶活性水平(圖1)

圖1 漢賽巴爾通體(105 cfu/μL)接種到長角血蜱未飽血雌蜱體內后總SOD酶活性的變化(n=103)Fig.1 Following changes on T-SOD activity in Haem aphysalis longicornis hemolym ph inoculation of Bartonella henselae(105 cfu/μL)into partially fed virgin females(n=103)

2.2 兩組之間各時間段的比較 通過對比以上的酶活性結果我們可以看出,在實驗組SOD酶活性一直處在一個較平穩的狀態,而對照組SOD酶活性先上升,12 h時達到高峰后降低。在酶活性最高時間段12 h時實驗組 SOD的酶活性值為(6.8365±2.0328)U/mL,對照組為(11.1999±1.3248)U/mL,兩組的差異有統計學意義(t=3.115,d f=4,P=0.036<0.05)。而到48 h時對照組的SOD酶活性下降到很低的水平,僅為(2.0611±0.6947)U/mL。

2.3 兩組組內各時間點的比較 通過對實驗組5個不同時間點酶活性的比較我們了解到,酶活性在各個時間點均處于穩定的狀態,各時間點間沒有統計學差異(F=1.065,d f=4,P=0.423);而對照組酶活性的變化出現很大的波動,12 h時酶活性達到最高水平,并且與1 h(P=0.005),24 h(P=0.000)及48 h(P=0.000)的酶活性均有統計學差異,在48 h時降為最低,與1 h時的酶活性相比有統計學差異(P=0.000)。

3 討 論

SOD是由 M cCord和 Fridovich等人在1969年首次從牛紅血球中分離得到的[12]。它普遍存在于生物體內,能清除超氧陰離子自由基,是生物體防御氧化損傷的重要金屬酶系之一。在生物體受到外來物質的刺激時,會產生活性氧(reactive oxygen species,ROS),此時生物體內的 SOD清除O2-·而產生 H2O2,過氧化氫酶和過氧化物酶又可以將 H2O2分解為 H2O和O2,從而使細胞內的自由基處于較低的水平,保護細胞免受損傷[13]。因此研究在病原體感染機體之后SOD的活性變化對了解機體的免疫防御能力有重要的意義。

SOD的酶活性在受到外來的刺激時會相應升高,但是當外來刺激作用很強,活性氧大量積累造成氧化損傷時則會使SOD的酶活性相應降低[14]。此次試驗我們觀察到長角血蜱在感染漢賽巴爾通體后,SOD的酶活性在一定時間內受到了抑制,這可能與細菌的存活狀態和機體受到的外界脅迫作用強度有關。實驗組SOD的酶活性在12 h前沒有像對照組那樣明顯升高,這可能是漢賽巴爾通體的侵染打亂了機體的氧化還原平衡狀態,活性氧大量累積,反而抑制了SOD的大量產生,從而使得巴爾通體實驗組SOD的酶活性在一段時間內僅微微升高,甚至在6 h時已開始下降,而對照組可能由于對機體的刺激適度,機體對其應激反應并不強烈,活性氧適量增加,誘導SOD酶大量增加,至12 h時與實驗組有了明顯的差異;而在12 h后,對照組隨著機體的逐漸適應,活性氧含量下降,SOD的酶活性也逐漸降低,至48 h時明顯低于1 h時的水平,而實驗組SOD可能由于漢賽巴爾通體尚未完全清除或在蜱體內存活下來,脅迫作用仍較強,使得SOD的酶活性并沒有明顯變化,至24 h后相對于對照組反而處于較高的水平。

本實驗僅記錄了蜱感染漢賽巴爾通體后48 h內的SOD酶活性變化結果,48 h之后實驗組的酶活性是持續降低還是會階段性上升,這種降低或升高與蜱體內漢賽巴爾通體的含量和生存狀態是否相關,如何相關?這些變化是否是導致巴爾通體能否成功感染蜱或其他宿主的原因之一,這些都有待進一步研究。

目前關于巴爾通體侵染蜱類之后兩者之間的生物學、病理學及生物化學的研究報道幾乎沒有,本實驗通過觀察漢賽巴爾通體進入蜱類體內之后其防御酶——超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化,以期可以分析蜱媒的防御酶系及蜱媒與病原體之間的相互適應結果,同時也為探討蜱媒對相關病原體的免疫應答機制提供線索。

(本研究得到本所碘缺乏病參照實驗室李素梅主任及該室各位老師和同學在儀器和儀器使用方面的大力支持,在此表示感謝。)

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Enzyme activity of SOD(Superoxide Dismutase)in Haemaphysalis longicornis ticksafter hemocoelic inoculation with Bartonella henselae

L IZhi-fang1,2,L IU Qi-yong2,ZHANGWei-dong2,SONG Xiu-ping2,L IDong-mei2,MA Huai-lei2,ZHAO Fan2,M ENG Feng-xia2,REN Dong-sheng2,JIN Jian-chao2,L IN Jie2,WU Hai-xia2
(1.Department of Epidemiology and Health Statistics,College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001;2.Department of Vector Biology and Control,State Key Laboratory for Infectious Diseases Prevention and Control,National Institute for Comm unicable D isease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China)

The aim of this experiment was to study enzyme activity of superoxide dismutase(SOD)in Haemaphysalis longicornis ticks and its change over time after Bartonella henselae had been inoculated into them.First,fivemicrolitres of B.henselae suspension(105cfu/μL)were injected into the hemocoelic cavity of partially fed virgin female H.longicornis using a 10μL Hamilton syringe.Then hemolymph samples were collected at 1 h,6 h,12 h,24 h and 48 h after inoculation.Finally,the activity of SOD was determined with the SOD detection kitmanufactured by Jiancheng,Nanjing.Theme thod was also repeated by using saline solution as control.The enzyme activity of SOD remained steady for 48 h in infected group.Whereas the control group,the enzyme activity peaked at 12 h(11.1 999±1.3 248U/m L)and higher than infected group,there was a difference between the two groups at 12 h(P=0.036);then the activity decreased at 48 h,and lower than that at 1 h(P=0.000).The result showed that the enzyme activity of SOD would be inhibited w hen H.longicornis was attacked by B.henselae in a certain period,which suggests that the B.henselae stress might be a supp ression factor with the enzyme activity of SOD over time o r concentration.

Bartonella henselae;Haem aphysa lis longicornis;Superoxide Dismutase

1.鄭州大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室,鄭州 450001;2.傳染病預防控制國家重點實驗室,中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所,北京 102206

R376

A

1002-2694(2011)06-0492-03

＊國家自然科學基金項目(No.30600513)資助

吳海霞,Email:w uhaixia@icdc.cn

2011-01-04;

2011-03-08