兒童遺傳性出凝血紊亂VWF FV GP1Bα基因研究

蔣玉鳳，羅建明

(1.廣 西 醫 科 大 學 研 究 生 院， 廣西 南寧 530021 2.廣西醫科大學第一附屬醫院兒科，廣西 南寧 530021)

遺傳性出凝血紊亂除了凝血因子缺乏外還包括血管性血友病因子(von Willeb rang factor，VWF)質或量的異常、血小板膜糖蛋白異常、五因子萊頓(factorV Leiden)突變、ADAMTS13、抗凝血酶、凝血素、蛋白 C或S缺乏等參與血液凝集的因素。兒童出凝血功能紊亂主要以先天性或遺傳為主，其根本的發病機制就是相關基因的變異引起相應的凝血或抗凝血因子缺乏。近年來有報道稱在中東部國家及印度南部除了常見的FⅧ、FⅨ缺乏外，FⅤ、FⅦ等缺乏也不少見，Pier Mannuccio Mannucci、Stefano Duga等科學家通過調查研究意大利及伊郎兩個國家的1103例隱性遺傳凝集紊亂病人已得到證實［1］;此外，近年來西方學者認為血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)發病率已高達1.3%［2］其發病率已超過血友病A占據首位。隨著近年來出凝血分子生物學的研究表明某些基因變異可導致血管內微血栓形成，如五因子萊頓突變(factorV Leiden)、血小板膜糖蛋白 α(GP1Bα)、ADAMTS13缺陷、以及參與凝血的VWF基因突變，如28外顯子A1區變異所致的2B型VWD［3，4］等。近年來發現一些不明原因出血以及雖診斷為ITP但經ITP治療效果不佳而經抗凝治療能取得較好療效的兒科病人在臨床所見不少，在這些病人中是否存在VWF、FⅤ、GPⅠba基因變異而導致出凝血功能紊亂呢?本文就此對2009年3月至2011年1月所收集的不明原因出血及ITP經常規治療不佳而經抗凝治療能取得較好療效的門診及住院病人行FV、VWF及GPⅠba基因進行研究，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象:收集2009年3月至2011年1月在我院兒科門診及住院部就診的不明原因出血，以及雖然臨床診斷為ITP，按ITP治療無效而經抗凝治療能取得較好的效果病例共31例，其中男13例女18例，平均年齡3.8歲。

1.2 方 法

1.2.1 標本采集與DNA提取:收集患兒外周靜脈血ACD抗凝，采用廣州東盛生物科技有限公司生產的血液基因組DNA提取試劑盒按試劑盒提取DNA。

1.2.2 引物設計:采用 Primer及 Oligel軟件對VWF28真基因進行特殊引物設計［5］，以及對FV10、GPⅠba DNA序列進行引物設計，具體引物見表1。

表1 VWF28、GPⅠba、FV10基因特異性引物序列、退火溫度及產物長度

1.2.3 聚合酶鏈反應(PCR):反應體系為50μL，反應在多通道PCR儀(PTC－220，美國MJ公司)上進行，95℃預變性4min;95℃變性45s;退火溫度見表1，45s;72℃延伸45s;總共32循環最后延伸10min。

1.2.4 PCR擴增產物的鑒定及DNA測序結果判讀:所有基因擴增后均經電泳后于凝膠電泳成像分析儀下觀察，呈現清晰、明亮、無拖尾的條帶并以DNA marker為參照，所擴增的產物均為所需目的條帶，見圖(1、2)。經PCR擴增成功的產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，并與GenBank中的正常序列進行Blast比對;VWF變異位點在國際VWF數據庫(http://www.vwf.group.shef.ac.uk/index.html)查詢;GPⅠba及 FV基因變異位點在(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)查詢。

圖1 第1、2、3泳道為VWF28、第4泳道及圖2第5泳道為FVF10PCR產物電泳結果

圖2 第1、2、3、4泳道為GPⅠba基因電泳結果

2 結果

所有病人VWF28、FV10及GPⅠba基因均成功擴增并測序，均未發現有意義的異常變異，在此實驗中所發現的基因突變類型經證實均為多態性位點(見表2)。在此研究中發現1例病人VWF28存在V1229I變異;1例病人GPⅠba基因存在T119S變異。為了排除多態性我們用同樣的方法對100例正常人進行了等位基因測序分析，發現各有2、3例正常人存在同樣的突變，由此推測為少見的多態性位點。

表2 31例患兒VWF28、GPⅠba、FⅤ10基因突變類型頻率

3 討論

在發展中國家遺傳性出凝血紊亂依然是影響人們生活質量的疾病之一，由于經濟文化較落后大部分病人都得不到有效的診斷與治療，甚至導致殘疾。生活質量嚴重降低，為家庭及社會帶來了沉重的負擔。我國有關學者統計1983年至2002年在北京大學就診的1312例出血凝集紊亂病人，其中血友病占89.8%、血管性血友病占5.1%、診斷不明確的凝集紊亂占1.7%。且大部病人出現出血癥狀的中位年齡都在嬰幼兒時期，遺憾的是大部病人確診的中位年齡都在10歲以后［6］。從本研究所收集的病例中出現癥狀的患兒平均年齡3.8歲，最小2月，與文獻［4］所報道的初次發病的年齡相仿。本研究還發現很大部分病人在出現較嚴重的癥狀前已有鼻出血或皮膚粘膜易出現瘀斑、瘀點現象，而往往在感冒發熱后病情加重而入院，這可能與外環境因素打破了出凝血平衡有關。值得提出的是由于大部病人在出現較嚴重的出血癥狀而就診，而一些只有輕型出血的病人往往被家長及醫生疏乎而漏診，比如I型VWD占所有VWD的75%且絕大部分只有輕至中度的皮膚粘膜出血［7］。我國相關學者2003年在國際上所發表的論文［6］所統計的VWD僅占出血凝集紊亂的1.7%，遠少于血友病89.8%的發病率，這與如今西方大部分學者已認為VWD是最常見的遺傳性出血性疾病且發病率已超過血友病A而居首位［2］完全不同。這可能與我國經濟及醫療水平較落后有關。從本文研究結果中得出，31例病人中未被檢出VWF基因變異，這可能與收集的標本量太少或只是對VWF28外顯子擴增，由此對于一些在VWF基因全長均可發生變異的VWD漏診，鑒于近年來西方學者對VWD的大量報道，值得我們對其進行學習及研究。

VWF是一種大分子糖蛋白，最先發現的變異在VWF基因28外顯子上，72%的變異位點都可在28外顯子上找到(http://mmg2.im.med.umich.edu vWF)。在本研究中就此僅對VWF基因第28外顯子擴增測序，發現1例病人存在V1229I變異，經查閱VWF國際數據庫發現在1998年及2007年分別在意大利、加拿大發現此同樣位點V1229G變異而導致1型VWD。經過對照研究，結果得出此位點為多態性位點，其發生率為2%。此外在VWF28外顯子發現的T1381A、D1472H、V1565L三個位點的突變均為多態性位點其發生頻率與國際VWF數據庫登記的頻率相仿。

初期止血的基本過程為當血管壁破損后血小板在大分子糖蛋白VWF因子幫助下其A1區與血小板GPⅠb受體結合完成初期止血功能，如血小板膜糖蛋白GPⅠb異常則會導致血小板粘附功能異常而出血。最常見的血小板型血管性血友病以GPⅠba基因突變為特點［8］。在本研究中54.8%的病人為診斷ITP但經ITP治療無效而適當口服抗凝藥卻能取得較好的療效，為此對本研究所收集的患兒都進行了有可能導致血管內微血栓形成的常見因子如VWF、GPⅠba、Fⅴ、進行基因研究，結果未發現異常突變，這有可能與所收集的病例數不夠或本身VWF、GPⅠBA、FⅤ基因發生異常變異機率非常小有關［9］。除此之外，ADAMTS13、抗凝血酶、凝血素、蛋白C、蛋白S缺陷也成為血管內微血栓形成的因素［10］，但由于基金原因未對上述基因進行研究有待以后相關學者對此展開更深入的研究。

［1］Pier Mannuccio Mannucci，Stefano Duga an，Flora Peyvandi.Recessively inherited coagulation disorders［J］.Blood，2004，104(5):1243－1252.

［2］Mannucci PM，Federici AB，James AH，et al.von Willebrand disease in the 21st century:current approaches and new challenges［J］.Haemophilia，2009，15(5):1154 －1158.

［3］Bertina RM，Koeleman BP，Koster T，et al.Mutation in blood coagulation factorⅤassociated with resistance to activated protein C［J］.Nature，1994，369:64 －67.

［4］Fressinaud D，Mazurier C，Meyer D.Molecular Genetics of Type 2 von Willebrand disease［J］.Hematol，2002，75(1):9－18.

［5］Yukihiro Satoh M D，Hiroto Kita M D，Ken Kihira M D，et al.Gastrointestinal Angiodysplasia in a patient with Type2 von Willebrands disease and Analysis of Exon 28 of the Von Willebrand Factor Gene［J］.Gastroenterol，2004，99(12):2495－2498.

［6］Zhang L，LI H，Zhao H，et al.Retrospective analysis of 1312 patients with haemophilia and related disorders in a single Chinese institute［J］.Haemophilia，2003，9(6):696 －702.

［7］The National Heart，Lung and Blood Institute.The Diagnosis，Evaluation and Management of Von Willebrand Disease，Bethesda，MD:Bethesda，MD:National Institutes of Health Publication 08 － 5832.2007［J］.httpwww.nhlbi.nihgov/guidelines/vwd.

［8］馬麗，周光紀.巨型血小板綜合征與血小板型血管性血友病［J］.國外醫學輸血及血液學分冊，2000，23(2).

［9］Sajid R，Khalid S，Mazari N，et al.Clinical audit of inherited bleeding disorders in a developing country［J］.Indian pathol Microbiol，2010，53(1):50 －53.

［10］Westrick RJ，Ginsburg D.Modifier genes for disorders of thrombosis and hemostasis［J］.Thrombosis and Hemostasis，2009，7(1):132 －135.