息風定顫湯對帕金森病模型大鼠多巴胺能神經元保護作用的研究＊

羅恩麗，鮑春齡，王德生

(1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州 510120;2.廣州中醫藥大學博士后科研流動站，廣州 510006;3.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437;4.哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院，哈爾濱 150001)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見于中老年中樞神經系統的變性疾病，其患病率隨年齡的增加而遞增，隨著社會人口老齡化現象的日趨加劇，成為嚴重影響人類健康的疾病之一[1]。目前本病尚無滿意治療方法，如何對PD患者進行積極有效而安全的治療是一項亟待解決的問題。近年來，通過我們的臨床觀察發現以補腎活血息風為基本治療原則的息風定顫湯不但能緩解PD臨床癥狀、延緩疾病進展，而且毒副作用較小，為對其作用機制等進行深入研究，故進行本實驗，觀察息風定顫湯對PD模型大鼠行為學的影響，并探討其作用機制，以期為息風定顫湯臨床治療PD奠定理論與實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康Wister大鼠200只，雌雄不拘，體重250g±20g，8～10周齡，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供，許可證號SCXK(黑)20020001。

1.1.2 藥品 將熟地、枸杞、珍珠母、天麻、肉蓯蓉、膽南星、全蝎等按6∶6∶5∶4∶3∶3∶1的比例稱量后由黑龍江中醫藥大學第一臨床醫院制劑室水煎醇沉，制成200%水溶液，0.1mPa滅菌15min 4℃保存備用。將全蝎等5味不適合水煎的藥物經去雜質、烘干等處理后粉碎達100～120目，于治療時按比例混入上述溶液中，充分搖勻灌服。以上所有中藥飲片均購自哈藥集團人民同泰藥店。美多巴由上海羅氏制藥有限公司生產，每片含200mg左旋多巴、50mg芐絲肼，批號SH0312。

1.1.3 試劑及主要儀器 6-羥基多巴胺(6-OHDA)、阿樸嗎啡(APO)、多巴胺(DA)標準品、3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-羥色胺(5-HT)及5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)均購自Sigma公司，酪氨酸羥化酶(TH)單抗購自Chemicon公司。

Narishinge ST-85-28型腦立體定位儀，日本Kasuya公司;HP1100型高效液相色譜系統檢測器，Aglient U.S.A;LC-10AD液相恒流泵，SHIMADZU，U.S.A;L-ECD-6A電化學檢測器，Aglient U.S.A;7125高壓六通進樣閥，RHEODYNE，U.S.A;ODSC18色譜柱(10μm，250×4.6mm)，美國迪馬公司;Olympus光學顯微鏡，日本Olympus公司;尼康DXM1200F數碼顯微成像系統，日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 制備PD模型大鼠 取180只Wistar大鼠，以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，顱平位固定于腦立體定位儀上，參照Paxinos等[2]大鼠腦立體定位圖譜，采用紋狀體兩點注射法制備PD模型大鼠，選左側紋狀體注射坐標點為:(1)前囟前1.0mm，向左旁開3.0mm，前后囟水平以下4.5mm;(2)前囟后1.0mm，向左旁開4.0mm，前后囟水平以下6.0mm。鉆顱后，取5μl微量進樣器緩慢垂直進針達相應坐標點，分別注入15μg/5μL新鮮配制的6-OHDA(溶于5μl含0.2%抗壞血酸的生理鹽水中)，注射速度為1.0μl/min，注射完畢后留針10min，然后以1mm/min的速度退針，縫合皮膚，清醒后放回籠內飼養。另取20只大鼠為假手術組，同上法于左側紋狀體區兩點各注射含0.2%的抗壞血酸生理鹽水5μl。

1.2.2 行為學測試及分組 分組:分別于術后3～6周對各組大鼠進行行為學檢測:給予背部皮下注射APO 0.5mg/kg(溶于無菌注射用水中)，誘發大鼠向健側旋轉。每次在注射APO 10min后即開始記錄，共記錄30min，如大鼠恒定轉向右側，且平均轉速≥7r/min，視為模型制備成功。

本實驗共制備模型成功鼠99只，隨機分為5組:美多巴組、中藥高、中、低劑量組各20只，模型組19只，另取左側紋狀體注射生理鹽水20只大鼠作為假手術組。分別給予美多巴(將美多巴研末加入蒸餾水配成9%的懸濁液)67.5mg/(kg·d)、息風定顫湯15g/(kg·d)、7.5g/(kg·d)、3.75g/(kg·d)，蒸餾水10ml/(kg·d)、蒸餾水10ml/(kg·d)灌胃治療，每日1次，連續4周。

1.2.3 行為學測試 分別于灌胃前、灌胃2周、灌胃4周后將各組大鼠皮下注射APO 0.5mg/kg誘發旋轉，記錄給藥后10min～40min內各組大鼠的旋轉次數，比較各組大鼠治療前后大鼠旋轉行為的改變。

1.2.4 單胺類神經遞質的測定 在行為學檢測完畢后，取模型組大鼠9只，其余組各取10只，立即斷頭取腦，干冰上迅速分離出雙側紋狀體并稱重、標記，置液氮中速凍后貯存于－70℃的超低溫冰箱內待測。測定前，將冰凍組織室溫融化，加入冰冷的0.4mmol/L高氯酸溶液(100mg組織加入1000μl高氯酸溶液)勻漿，高速離心(12000rpm 20min 4℃)，取上清液50μl進樣，應用高效液相色譜電化學檢測器(HPLC-ECD)測定單胺遞質的含量。

色譜條件:色譜柱:DiamonsilTMC18200×4.6mm，內徑5μm;流動相:85mmol/L乙酸鈉，100mmol/L檸檬酸，0.9mmol/L辛烷磺酸鈉，0.2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，甲醇(85∶15，V/V);電化學檢測器的工作電極為玻璃碳，參比電極為固態的Ag/AgCl;檢測電壓為+0.7 V;流速為1.0ml/min;柱溫30℃。各種待測物質均得到良好分離。

單胺類神經遞質含量的計算:采用峰面積法對待測物質定量。

1.2.5 TH免疫組化檢測 末次行為學測試后，每組各取10只大鼠，麻醉后灌注、固定，制作中腦(在灰白結節后緣向腦干方向作冠狀切面)病理組織片，用ABC法進行TH免疫組化檢測。

1.2.6 TH圖像分析和統計方法 采用尼康(Nikon)DXM1200F數碼顯微成像系統對切片進行圖像分析，每例TH免疫組化切片為緊鄰的3張切片，每張片子取中腦腹側被蓋區和黑質致密區各2個視野，測錄窗為90588.11mm2。

2 結果

2.1 模型制備情況

該實驗模型成功率為55%，模型成功的大鼠平均旋轉圈數為10.44±4.73r/min。標準的PD模型大鼠于6-OHDA損毀術后3～4周，即表現出輕微的向健側旋轉行為，同時四肢肌張力稍增高，以前肢明顯，伴見步態不穩及輕微震顫。3～6周后，背部皮下注射APO后即出現尾僵直、震顫、好斗、對外界刺激敏感、易于激惹及步態不穩等，0.5min～5min后動物表現為向健側旋轉行為，旋轉時身體側曲成環狀，頭尾相接，在原地以健側下肢為支點向健側單一方向旋轉，同時伴見向健側的嗅探、覓食、咬、舔等動作。旋轉行為在給藥后15min～30min內最為迅速，30min后旋轉明顯變慢，50min～60min時旋轉基本停止。

2.2 息風定顫湯對PD模型大鼠旋轉行為的影響

表1 各組大鼠治療前后平均旋轉圈數的變化

表1 各組大鼠治療前后平均旋轉圈數的變化

注:與灌胃前比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 假手術組 模型組 美多巴組 中藥高劑量組 中藥中劑量組 中藥低劑量組灌 胃 前 0 10.48±6.41 10.42±5.25 10.47±4.11 10.43±3.82 10.47±3.69灌胃后2周 0 10.48±5.61 7.41±3.80＊△ 8.82±4.35 7.86±3.14＊△ 8.57±3.79灌胃后4周 0 10.54±6.46 8.14±4.49 7.39±4.24＊△ 4.92±2.54＊＊△△ 7.51±3.64＊△

可見，隨著治療時間的延長，中藥高、中、低劑量組大鼠的行為學改變明顯好轉，以中藥中劑量組改善最明顯。同時可見，3組大鼠皮下注射APO后所出現的尾僵直、震顫、四肢肌張力增高及步態不穩等也有明顯改善，較治療前安靜、不易激惹。而美多巴組大鼠在給藥后2周有1/3大鼠在灌服美多巴30min后出現對側自發旋轉行為，有1/2大鼠出現灌服美多巴30min后萎靡不振、僵住不動、刻板動作(損毀側上肢節律性不自主拍擊動;頭頸、軀干向對側側彎和扭轉;不自主咀嚼、舔食作)等表現，且灌胃4周后，平均旋轉圈數不較2周減少。這可能與美多巴的神經毒性有關。

表2 各組大鼠紋狀體單胺類神經遞質含量測定的比較

表2 各組大鼠紋狀體單胺類神經遞質含量測定的比較

注:與本組損毀對側比較:※P＜0.05，※※P＜0.01;與假手術組損毀側比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組損毀側比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

假手術組 模型組 美多巴組 高劑量組 中劑量組 低劑量組DA 損毀對側 10.85±3.15 11.80±0.98 11.72±1.99 10.69±2.60 11.10±4.33 11.20±3.23損 毀 側 11.68±1.91▲▲ 0.22±0.14※※△△ 5.96±3.11※△▲ 3.44±2.87※※△△ 8.68±5.51▲▲ 4.82±2.42※△▲HVA 損毀對側 0.22±0.10 0.18±0.04 0.17±0.07 0.14±0.05 0.17±0.08 0.18±0.06損 毀 側 0.24±0.07▲ 0.08±0.03※※△ 0.07±0.03※△ 0.06±0.02※※△△ 0.13±0.08 0.08±0.04※△DOPAC 損毀對側 0.25±0.13 0.28±0.06 0.26±0.08 0.27±0.11 0.22±0.13 0.27±0.15損 毀 側 0.15±0.02▲▲ 0.02±0.01※※△△ 0.13±0.09※▲ 0.10±0.06※ 0.21±0.13▲▲ 0.09±0.04※△5-HT 損毀對側 0.34±0.20 0.28±0.19 0.36±0.07 0.33±0.12 0.26±0.15 0.28±0.17損 毀 側 0.31±0.11 0.29±0.09 0.33±0.11 0.36±0.20 0.34±0.13 0.30±0.08 5-HIAA 損毀對側 0.20±0.11 0.14±0.05 0.16±0.05 0.15±0.03 0.10±0.06 0.13±0.06損 毀 側 0.13±0.02 0.12±0.03 0.16±0.05 0.18±0.04▲ 0.16±0.06△0.13±0.03

圖1 各組大鼠中腦被蓋部TH免疫組化染色比較(400×)

2.2 紋狀體單胺類神經遞質的檢測結果

可見，美多巴、中藥高、中、低劑量均能增加PD模型大鼠紋狀體DA及HVA、DOPAC含量，其中中藥中劑量組增加最顯著，而5-HT、5-HIAA在上述幾組大鼠損毀對側、損毀側沒有明顯的差異。

2.3 TH免疫組化檢測結果

光鏡觀察可見，TH陽性細胞形態為多角形或椎形細胞，胞漿被染成棕褐色，主要分布于中腦腹側被蓋部和黑質致密部、網狀部。由于每只大鼠中腦切片所取的部位很難完全一致，故我們采用每只大鼠損毀側和損毀對側的TH陽性細胞數的比值進行比較(結果見表3圖1)。

實驗結果可見，美多巴、中藥高劑量、中藥中劑量和中藥低劑量均能明顯增加PD模型大鼠TH的表達，但以中藥中劑量最明顯，其次是美多巴及中藥高劑量，最后是中藥低劑量。

表3 各組大鼠中腦TH免疫組化檢測結果

表3 各組大鼠中腦TH免疫組化檢測結果

注:與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與假手術組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 損毀側(個) 損毀對側(個) 損毀側/損毀對側(%)假手術組 251.80 ±9.39＊＊ 269.2 ±10.23 95.13±22.77＊＊模 型 組 41.01 ±18.88△△ 231.29±21.42△△ 17.92±8.69△△美多巴組 180.78±71.13△△＊＊ 243.20±25.57△ 73.43±26.34＊＊△高劑量組 166.48±19.48△△＊＊ 236.20±20.38△ 70.82±9.97＊＊△△中劑量組 224.16 ±19.85＊＊ 264.17±14.89＊＊ 85.01±7.83＊＊低劑量組 89.36 ±34.33△△* 227.43±22.59△△ 36.36±21.79*△△

3 討論

PD從臨床表現上看，大致相當于中國醫學之“掉”、“振掉”、“痙癥”、“拘攣”、“顫振”、“顫癥”等范疇。因本病以風氣內動為病機要點，肝腎虧虛為主，兼以脾之氣血不足，痰瘀阻滯，故治當以補肝腎、活血化痰、息風止痙為主，少佐益氣養血之品。據此治則，臨床我們觀察發現，補腎活血息風化痰法在治療本病時不但能緩解臨床癥狀、延緩疾病進展，而且毒副作用較小。為了闡明中藥治療的作用機制，我們精選了十幾味藥物組成息風定顫湯進行動物實驗研究。方以熟地、山萸肉、枸杞等補益肝腎;天麻、鉤藤等平肝息風、定顫止痙;加之全蝎等蟲類藥搜風藥增強其息風止痙之功效，佐以化痰活血通絡;以三七等活血化瘀;并佐以黃芪、白芍等補益氣血陰陽之不足。全方以補肝腎、息風止痙、活血為主，佐以化痰、補益氣血，共奏息風定顫止痙之功效，使震顫、強直、少動等癥狀緩解。

PD大鼠藥物誘導的旋轉行為學改變，與中腦、紋狀體DA以及TH的減少程度密切相關，可直接反映黑質紋狀體DA能神經元變性壞死程度。由于迄今尚無有效的非侵襲性生理學方法檢測PD大鼠中腦DA能神經系統的損毀程度，故檢測造模大鼠的旋轉行為已成為衡量模型制作成功與否、判定模型損傷程度及治療效果好壞的最常用手段[3、4]。本實驗中息風定顫湯高、中、低劑量組灌胃治療后旋轉行為均有所改善，并隨著治療時間的延長，行為學改變明顯好轉，且APO皮下注射后，所出現的尾僵直、震顫等均明顯好轉，治療后大鼠較前安靜、不易激惹。說明息風定顫湯是治療PD模型大鼠的有效藥物，并隨著時間的推移療效增加，以中劑量效果最好。這可能是由于灌胃治療后使DA的含量增加，緩解了模型動物損毀側紋狀體內由于末梢退變而誘導的突觸后D2受體超敏和受體數目增多的現象。因此使用DA受體激動劑APO時，它所誘導產生的PD模型大鼠向健側的旋轉行為也減少了。

單胺類神經遞質(DA及其代謝產物)含量減少是PD的主要神經生化改變，其減少的程度與黑質細胞喪失的程度成正比，因此中腦黑質紋狀體DA的含量測定是衡量治療PD有效與否的最客觀指標。本實驗采用高效液相色譜電化學法測定DA、HVA和DOPAC含量，發現中藥高、中、低劑量組大鼠損毀側紋狀體DA含量、HVA、DOPAC含量均有明顯增加，其中中劑量組增加最明顯，說明息風定顫湯能促進DA的釋放，顯著增加PD大鼠紋狀體DA及代謝產物含量，補充黑質紋狀體DA的不足，提高DA能神經元的活動，增強運動能力，從而改善PD模型大鼠的旋轉行為。這為中藥治療PD提供了有力的神經化學依據。

TH是DA合成的限速酶，TH是DA合成的主要調節因素，是DA合成的限速酶，在PD的病理生理中發揮著重要作用。PD動物模型和患者體內TH從基因表達到酶蛋白含量及酶的活性都有廣泛的異常改變【9】。實驗研究發現，6-OHDA損毀DA能神經元嚴重程度與TH陽性的細胞被破壞的程度是密切相關的[5]。TH陽性細胞表達的多少不僅體現DA能神經元被破壞的程度，同時可用來判定PD治療效果。本實驗結果顯示，中藥高、中、低劑量組TH的陽性細胞表達均較模型組顯著增加，說明息風定顫湯對6-OHDA誘導的PD模型大鼠黑質DA能神經元具有保護作用。

綜上所述，可見息風定顫湯可通過上調TH的表達，增加DA能神經元DA的釋放，對多巴胺能神經元具有保護作用改善PD模型大鼠的旋轉行為。說明息風定顫湯是治療PD模型大鼠的有效藥物，以中劑量療效最好，并揭示了其作用機制，從而為息風定顫湯臨床治療PD奠定了理論與實驗基礎。

[1]Zhen-Xin Zhang，Gustavo C Roman，Zhen Hong，et al.Parkinson’s disease in China:prevalence in Beijing，Xian and Shanghai[J].Lancet，2005，365:595-597.

[2]Paxinos G，Watson C.The rat brain in stereotactic coorchonates[M].Sydney:Academic Press，1985:11-28.

[3]Schwating RK，Huston JP.The unilateral 6-hydroxydoppamine lesion model in behavioral brain reseaech.Analysis of functional deficits，recovery and treatments[J].Prog Neurobiol，1996，50:275-331.

[4]呂勝青，張可成，劉海鵬，等.微囊化大鼠嗜鉻細胞瘤細胞移植后帕金森大鼠旋轉行為變化研究[J].中國行為醫學科學，2000，9(2):18-20.

[5]Haavik J，Toska K.Tyrosine hydroxylase and Parkinson’s disease[J].Mol Neurobiol，1998，16(3):295-309.