黃芪多糖對內毒素誘導巨噬細胞產生TNF-α、IL-1β及NO的影響＊

徐 荔，何小鵑，柴 旺，鞠大宏，呂愛平，喻長遠△

(1.北京化工大學，北京 100029;2.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700;3.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

黃芪是常用的“扶正固本，補益中氣”藥物，其化學成分復雜，含有多糖、多種皂甙、黃酮以及氨基酸、亞油酸、生物堿等。其中黃芪多糖(Astragalus Polysaccharide，APS)是黃芪中含量最多、免疫活性最強的一類物質，具有增強機體免疫、擴張冠狀動脈、改善心臟功能、增強抗氧化能力、防止脂質過氧化、改善腎臟功能、防止肝糖原減少、抗衰老等多種功能及藥理功效[1～3]。本實驗以人單核巨噬細胞系U937細胞為研究對象，采用體外培養方法，觀察黃芪多糖對LPS誘導的U937細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β及一氧化氮(NO)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

U937細胞(購自北京協和醫院基礎醫學研究所細胞中心);RPMI1640培養基(美國Gibcol公司);胎牛血清(美國Gibcol公司);雙抗(美國Sigma公司);脂多糖(lipoplysaccharide，LPS)(美國Sigma公司);佛波酯(Phorbolmyristateacetate，PMA)(美國Sigma公司);Human TNF-α Instant ELISA，Human IL-1β Instant ELISA試劑盒(美國eBioscience公司);Griess Reagent System試劑盒(美國Promega公司);黃芪多糖(天津賽諾制藥有限公司，批號081201)。

1.2 儀器

CO2培養箱(美國Thermo公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);酶標分析儀(美國Thermo公司);以上均為中國中醫科學院中醫基礎理論研究所儀器。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 U937細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，于37℃，5%CO2培養箱中靜置培養。

1.3.2 ELISA檢測TNF-α、IL-1β含量 選對數生長期的U937細胞，用RPMI1640完全培養基調整細胞濃度至4×105/ml接種于24孔板，每孔1ml，加PMA誘導48h成熟后，吸棄全部上清液，實驗組每孔加入1ml LPS(1μg/ml)，另設對照組加入1ml RPMI1640培養基，置于37℃5%CO2的培養箱中作用1h后，實驗組加入不同濃度的APS 200μl，使其終濃度為37.5μg/ml～150μg/ml，不加APS的LPS組及對照組每孔加入200μl PBS，置37℃5%CO2培養箱繼續培養。24h后收集各組細胞上清液，采用酶聯試驗免疫吸附(ELISA)實驗，測定各組細胞上清液中TNF-α，IL-1β的含量。方法均按ELISA試劑盒說明書進行，于酶標儀上測定450nm時的吸光度值。每孔設3個復孔，取平均值。

1.3.3 NO含量 選對數生長期的U937細胞，用RPMI1640完全培養基調整細胞濃度至4×105/ml接種于24孔板，每孔1ml，加PMA誘導48h成熟后，吸棄全部上清液，實驗組每孔加入1ml LPS(1μg/ml)，另設對照組加入1ml RPMI1640培養基，置于37℃5%CO2的培養箱中作用1h后，實驗組加入不同濃度的APS 200μl，使其終濃度為37.5μg/ml～150μg/ml，不加APS的LPS組及對照組每孔加入200μl PBS，置37℃5%CO2培養箱繼續培養。24h后收集各組細胞上清液，采用Griess檢測法測定各組細胞上清液中NO的含量。方法均按NO試劑盒說明書進行，于酶標儀上測定540nm時的吸光度值。每孔設3個復孔，取平均值。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 U937細胞經PMA誘導成熟

圖1顯示，常規培養的U937細胞為懸浮細胞，將其培養在含有10ng/mlPMA的培養基中，48h后90%細胞貼壁，從懸浮生長變為貼壁生長，并呈典型的巨噬細胞形態。

2.2 APS對LPS誘導的U937細胞產生TNF-α的影響

圖1 PMA誘導U937成熟(40×)

表1顯示，LPS作用于PMA誘導的U937巨噬細胞后，細胞上清液中的 TNF-α含量明顯增加，與對照組比較，具有顯著差異(P＜0.01)。APS各濃度組細胞上清液中的TNF-α含量明顯低于 LPS組(P ＜0.05)，其中當 APS 終濃度為 75μg/ml和150μg/ml時，細胞上清液中的TNF-α含量顯著低于LPS組(P ＜0.01)。

表1 APS對LPS誘導的U937細胞產生TNF-α的影響

2.3 APS對LPS誘導的 U937細胞產生 IL-1β的影響

表2顯示，LPS作用于PMA誘導的U937巨噬細胞后，細胞上清液中的IL-1β含量明顯增加，與對照組比較，具有顯著差異(P＜0.05)。APS各濃度組細胞上清液中的IL-1β含量明顯低于LPS組(P＜0.05)，其中當 APS終濃度為 75μg/ml和 150μg/ml時，細胞上清液中的 IL-1β含量顯著低于 LPS組(P ＜0.01)。

2.4 APS對LPS誘導 U937細胞產生NO影響

表3顯示，LPS作用于PMA誘導的U937巨噬細胞后，細胞上清液中的NO含量明顯增加，與對照組比較，具有顯著差異(P＜0.01)。APS各濃度組細胞上清液中的 NO含量明顯低于 LPS組(P＜0.01)。

表2 APS對LPS誘導的U937細胞產生IL-1β的影響

表3 APS對LPS誘導的U937細胞產生NO的影響

3 討論

黃芪是常用的益氣健脾中藥之一，黃芪多糖是黃芪的一種重要的單體成分。黃芪多糖是一種免疫調節劑，可以調節機體的免疫功能，從而增強機體抗炎和抗病毒效應。本研究首先檢測了黃芪多糖對U937細胞活力的影響，確定對U937細胞活力影響不明顯的濃度范圍，進行后續正式實驗。結果表明，黃芪多糖濃度為 37.5μg/ml～150μg/ml時對 U937的活力影響不明顯(數據未列出)，因此我們采用該濃度范圍內(37.5μg/ml～150μg/ml)的黃芪多糖進行后續實驗研究。

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，具有抗腫瘤、抗感染和免疫調節等重要作用，在固有免疫應答中發揮重要作用，并參與特異性免疫應答[4]。正常情況下，巨噬細胞通過吞噬異物、細菌、衰老和突變細胞以維持機體的免疫穩態，同時活化的單核巨噬細胞能分泌大量的趨化因子和炎癥因子，參與機體固有和獲得性免疫調節[5]。近年來的研究表明，活化的巨噬細胞產生近百種的活性物質，如 TNF-α、IL-1β、NO等，其中許多與免疫應答及炎癥有關。TNF-α和IL-1β等為前炎癥細胞因子或早期細胞因子，是啟動炎癥反應的關鍵細胞因子。TNF-α是機體應激反應產生最早的炎癥介質，起最核心的作用[6]。TNF-α的出現能誘發機體代謝和血流動力學明顯變化，促進炎癥介質生成。IL-1β主要存在于血循環中，能誘導出與 TNF-α相似的生理和代謝改變，且能與TNF-α產生相互協同作用引起血管擴張和白細胞介導的組織壞死，從而導致器官衰竭[7]。NO廣泛分布于生物體的各組織器官，參與機體多種重要的生理病理活動。最新的研究表明，NO具有廣泛的免疫學意義，其作為炎癥介質參加體內免疫應答反應[8]。本實驗利用 LPS體外誘導巨噬細胞產生炎癥因子并使用黃芪多糖干預，觀察黃芪多糖對LPS誘導巨噬細胞產生炎癥因子的影響。結果表明，黃芪多糖能夠顯著降低LPS誘導巨噬細胞產生的TNF-α、IL-1β及 NO，提示黃芪多糖可能用于炎癥等相關疾病的治療。

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