聚苯乙烯核-聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)殼熒光素微球制備方法的研究

姚晚俠,楊 彪,李 群,孫耀杰

聚苯乙烯核-聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)殼熒光素微球制備方法的研究

姚晚俠1,2,楊 彪3,李 群3,孫耀杰3

(1.西安交通大學醫學院第一附屬醫院,陜西西安 710061;2.西安交通大學生命科學與技術學院,陜西西安 710049;3.復旦大學信息科學與工程學院,上海 200433)

目的：為制備性能良好的核殼結構熒光微球,探討了加料方式、引發劑選擇、交聯劑使用、pH調節、濃度配比和溶脹處理等反應條件對形成殼結構的效果以及形態學上的影響。方法：通過以乳液聚合得到的熒光素微球為核,以丙烯酰胺、丙烯酸為殼結構的聚合單體,制得了聚苯乙烯核-聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)殼熒光素微球。結果：熒光顯微鏡顯示：粒徑均一,分布范圍 7～8μm。紅外吸收光譜證實了聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)殼結構以及表面酰胺基的存在。該種子聚合反應的最佳條件為：在不使用交聯劑的前提下以偶氮二異丁腈為引發劑,經過 40 h的乙醇溶脹處理,70℃反應 3 h,反應過程 pH值在 6～7之間。該熒光微球的平均載藥量和包封率分別為 25.14%和90.21%,其熒光釋放率 40 h后穩定在 30%左右。結論：用此法制備的微球具有良好的熒光性能和明顯的核殼結構,分散性和穩定性良好,其載藥量和包封率也相對穩定,并具有良好的緩釋性能。

微球體;熒光素類;丙烯酰胺 /化學;聚苯乙烯 /化學;聚合物;乳狀劑;工藝學,制藥

[J Zhejiang Univ(Medical Sci),2011,40(1)：44-50.]

隨著生命科學和熒光分析技術的發展,熒光分析已經滲入到了生物學和醫學的各個領域,包括生物物理學、生理學、生物化學、分子生物學、藥理學、免疫學、細胞學、遺傳學等。從研究的材料來看,包括氨基酸、蛋白質、核酸、維生素、酶、藥物、毒物等多種物質。尤其隨著熒光顯微鏡和流式細胞儀以及激光掃描共聚焦顯微鏡的出現,熒光探針在細胞標記[1]、藥物篩選、蛋白檢測、DNA檢測、生物膜結構和動力學,以及膜結構和膜通透性等方面已經得到了廣泛的應用[2]。核殼結構的高分子微球,是一種由中心粒子為核,不同組分為殼層而組成的具有特殊結構的聚合物粒子,核與殼分別富集不同的化學成分[3]。由于核殼高分子微球的核、殼之間可能存在接枝、互穿或者離子鍵合,它不同于一般的共聚物或聚合物共混物,在相同原料組成的情況下,微球的核殼結構化可以顯著提高聚合物的耐磨、耐水、耐候、抗污、防輻射性能,以及抗張強度、抗沖強度和粘接強度,改善其透明性,并可顯著降低最低成膜溫度,改善加工性能。近年來,人們通過化學和物理的手段 (如交聯、包埋、附著和反應)賦予核殼高分子微球以光導、電導、熱敏和磁性等功能,并廣泛應用于電子、生物、醫藥和塑料、涂料、復合材料等許多領域。因此,核殼高分子微球作為一種新型材料,具有重要的應用價值和前景,已成為近年來高分子領域的研究熱點[4]。但是,目前納米核殼結構的制備工藝尚不夠完善,形成機理認識還不夠深入[5]。而且,國內該領域的研究重點主要集中在以下幾個方面：①通過結構方面的研究,完善核殼結構粒子的形成機理;②通過調節復合粒子的結構、形態和大小,使結構和物質組成多元化,粒徑與形態特殊化,進一步開拓材料性能;③研究表征核殼結構納米復合粒子的新技術;④拓寬研究開發體系,改進合成方法,使應用得以產業化,更好地滿足人們的需求[6]。

考慮到生物醫學等領域的應用要求,熒光素微球必須具備生物相容性[6]、水溶性、可與蛋白質等生物大分子交聯等特性。這就在某種程度上限制了制備的方法和所使用的材料,再加上工業生產要求工藝放大等后續工作,在合成時間的長短、反應條件的苛刻與否、成本等因素的約束。因此,本研究將殼結構的單體確定為水溶性很好、有氨基、易獲得的丙烯酰胺,并以聚苯乙烯熒光素微球為核,經過溶脹法處理之后,以聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)為殼制備了核-殼結構的熒光素微球。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 熒光素 (Flu,分析純,沈陽市試劑三廠),丙烯酰胺 (AAM,優級純,常州利安化工有限公司),丙烯酸 (AA,分析純,天津化學試劑三廠),過硫酸鉀 (KPS,分析純,西安化學試劑廠),偶氮二異丁腈 (A IBN,化學純,上海山浦化工),N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺 (MBA,分析純,西安化學試劑廠),苯乙烯 (St,分析純,西安化學試劑廠)等。HH-2電熱恒溫水浴鍋 (北京科偉永興儀器),JJ-1精密增力電動攪拌器(常州國華電器),CL-4A磁力加熱攪拌器 (鄭州長城科工貿),AnkeTGL-16C離心機 (上海安亭科學儀器廠),循環水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿),CX41科學顯微鏡 (Canon A 650,Olympus),M illipore去離子水機 (M illi-Q)。

1.2 方法

1.2.1 苯乙烯熒光素微球的制備過程 在通有氮氣導管的三口瓶中分別加入 30 ml水、5 ml St、3 ml Eth和 25 mg Flu,在 70℃、200 r/min下攪拌,隨后加入 0.2 g KPS引發體系。整個過程由氮氣保護,5 h后停止反應,將產物透析,備用。苯乙烯-熒光素微球的制備方程式[7]：

1.2.2 反應條件

1.2.2.1 加料方式及單體濃度 用半連續(饑餓態)加料法做對比實驗。①預處理：20 ml苯乙烯-熒光素微球 +2 ml乙醇 +0.2 g KPS+1.0 g AAM+5 ml水,超聲處理 10 min使 KPS完全溶解,并通 N2保護。將 0.5 g AAM溶于 9 ml去氧水中 (2.0 g溶于 12.5 ml去氧水中作對比);②種子聚合：水浴溫度達到 70℃時加入混合液,并不斷調節 pH至 6～7,待 pH不再明顯變化時開始滴加 AAM溶液,每 5 min加 0.5 ml。5 h后停止反應,在反應過程中每 30 min鏡檢 1次。

1.2.2.2 引發劑的選擇 預處理兩組平行樣品,A組：15 ml熒光微球 +10 ml乙醇 +0.5 g AAM+0.1 g A IBN;B組：15 ml熒光微球 +10 ml乙醇 +0.5 g AAM+0.1 g KPS。將 0.5 g AAM溶于 9 ml去氧水中備用,A組和 B組反應 30 min后分別加入 50μl AA,2 h后加 AAM溶液,0.5 ml、30 min,在反應過程中每 30 min鏡檢 1次。

1.2.2.3 交聯劑的使用 預處理：15 ml熒光微球 +10 ml Eth+0.5 g AAM+0.1 g A IBN。30 min后加 50μl AA,40 min后加入 0.01 g MBA,在反應過程中每 30 min鏡檢 1次。

1.2.2.4 pH的調節 預處理同 1.2.2.1,加入丙烯酸后不調節 pH,3 h后繼續反應,在反應過程中每 30 min鏡檢 1次。

1.2.2.5 微球濃度的選擇 預處理：15 ml St微球 +10 ml Eth+0.5 g AAM+0.1 g A IBN,種子聚合方法同 1.2.2.2節,在反應過程中每 30 min鏡檢 1次。

1.2.2.6 溶脹效果 按 1.2.2.1節預處理組分,直接將微球進行種子聚合,在反應過程中每30 min鏡檢 1次。按預處理組分加入各試劑,放置 24 h,按 1.2.3.2節步驟合成,在反應過程中每 30 min鏡檢 1次。

1.2.3 最優制備方法

1.2.3.1 預處理 將 1.2.1節中得到的苯乙烯熒光素微球進行預處理：向 100 ml燒杯中加入去離子水,用磁力加熱攪拌器加熱至沸騰,保持沸騰狀態 2 min后停止加熱,并加蓋靜置至室溫,得到去氧水備用。向錐形瓶中依次加入5 ml熒光素微球、20 ml乙醇、1.5 g AAM、0.3 g A IBN和 10 ml去氧水,振蕩均勻后放入 4℃冰箱 40 h左右。

1.2.3.2 種子乳液聚合 將三頸瓶和攪拌棒固定在精密增力電動攪拌器下,并向三頸瓶中加入 10 ml去氧水,置于 70℃水浴鍋中。水浴加熱到 60℃時,通入 N2排出空氣。待水浴溫度達到 70℃時開啟攪拌器,將經過預處理的混合液逐滴加入至三頸瓶中,用黑塑料袋將三頸瓶蓋住避光。反應 30 min后,加入 50μl AA,并用 1 mol/L的 NaOH溶液調節 pH至 7左右,3 h后停止反應。

2 結 果

2.1 反應條件探究

2.1.1 加料方式的影響 在半連續 (饑餓態)加料實驗過程中,發現有部分不理想的核殼式結構出現,而且體系黏度不斷增大 (圖 1)。

2.1.2 引發劑選擇的影響 在引發劑的探究實驗中,以 KPS為引發劑時幾乎沒有成型的殼,而以 A IBN為引發劑,反應 150 min左右時出現了大量的、明顯的具有核殼式結構的微球,而且體系黏度大。

圖1 半連續加料條件下的核殼式熒光素微球Fig.1 Polystyrene core-poly (acrylamide acrylic acid) shell fluorescent microspheres under condition of semicontinuous feeding

2.1.3 交聯劑使用的影響 受到聚丙烯酰胺凝膠電泳做膠過程所用方法的啟發,考慮能否加入交聯劑 N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺 (MBA),使AAM分子在聚合過程中由線狀變成網狀,從而更有利于成殼式的碰撞和附著。基于以上想法設計了對比實驗,結果是反應 2～3 h后體系黏度急劇增大,溶液成稀膠水狀,放干后出現一層凝膠,甚至影響光鏡下對微球的觀察。

2.1.4 pH調節的影響 加入丙烯酸后若不調節 pH則體系為酸性 (pH≈3),反應前 3 h內有少量核殼結構熒光素微球產生,但在 3 h后,微球逐漸破裂直到最后完全分散,觀察不到微球的存在。

2.1.5 濃度配比的影響 在濃度的探究實驗中,反應過程中只發現有個別微球有很好的殼結構,大部分微球仍然保持原來的核的形態。隨著反應的進行,微球開始出現凝聚現象。

2.1.6 溶脹效果 不進行溶脹處理的一組,幾乎沒有核殼結構生成。溶脹處理 24 h后進行種子聚合的一組,3 h后部分微球有明顯的核殼結構生成,但大部分仍然保持核的結構。

2.2 粒徑分析

2.2.1 苯乙烯-熒光素核 按照 1.2節所述方法制備的苯乙烯熒光素微球形態規則,粒徑約為 1μm,且分布較為均一,在溶液中分散性好,無團聚現象,在熒光顯微鏡下可以觀察到足夠的熒光性 (圖 2),可以用作制備高分子殼的種子。

圖2 苯乙烯-熒光素微球的光鏡照片Fig.2 Optical microp ho to of polystyrene fluoresce in microspheres

2.2.2 丙烯酰胺-丙烯酸殼 本實驗產物大致形成了 4種結構的球：①原來的核上已有十分明顯的殼結構;②核不在核-殼式微球正中間的結構;③2個甚至更多的核被包在一起的結構;④沒有包上或者正在包的熒光核 (圖 3)。這都直接或間接地證明了視野中所看到的大量的微球是核殼結構的熒光素微球。

圖3 苯乙烯核-(丙烯酰胺-丙烯酸殼)熒光素微球的光鏡照片Fig.3 Optical microphoto of polystyrene corepoly (acrylamide-acrylic acid) shell fluorescentmicrospheres

2.3 熒光性質表征 在熒光激發光和普通光下用顯微鏡對得到的產物進行表征 (圖 4)。通過對比可知,制得的核-殼微球熒光性能良好。微球與溶液背景顏色反差較大,即溶液中熒光素濃度較低,說明核-殼結構可以較好地解決熒光泄漏的問題。

圖4 同一視野下的熒光光源和普通光源顯微照片Fig.4 Microphotos polystyrene core-poly(acrylamide-acrylic acid) shell fluorescent microsp heres with and without fluorescence under the same visual field

2.4 紅外吸收光譜分析 分別將苯乙烯熒光素微球核和制得的經過透析處理的具有核-殼結構的苯乙烯熒光素微球在真空干燥儀中干燥后進行傅里葉變換紅外光譜 (FT-IR)分析,得到的紅外吸收光譜 (圖 5)。

圖5 苯乙烯核與核殼微球的紅外吸收光譜Fig.5 Infrared absorption spectrum of polystyrene core and core-shell microsp heres

從種子核的譜圖上：698 cm-1和 756 cm-1處有 2個大的吸收峰,這是苯環的 C-H面外彎曲振動峰;同時 ,在 1 450 cm-1和 1 490 cm-1處也有較大的吸收峰,這是苯環的骨架振動吸收峰,在 2 850 cm-1和 2 920 cm-1處的吸收峰為飽和 C-H的伸縮振動吸收峰;在3 024 cm-1、3 049 cm-1和 3 059 cm-1處的吸收峰為不飽和C-H的伸縮振動吸收峰;在1 727 cm-1,1 871 cm-1和 1 938 cm-1范圍內一系列較弱的吸收峰為苯環 C-H鍵彎曲振動的倍頻和組頻峰。這都證明了 St核中苯乙烯的存在。而核殼微球中這幾組卻缺失了,可見 St核確實被包裹在核殼微球之中,甚至產生了一定的變化。從圖中還可以看到,在 3 462 cm-1處有一個寬化的強吸收峰,為 O-H和 N-H的重疊伸縮振動吸收峰;1 652 cm-1處的強吸收峰為 C=O的振動吸收峰,這表明羧基和酰胺基的存在。另外,在寬峰處,核殼微球比 St核吸收率高,表明 St殼有更多的氨基,進一步說明了丙烯酰胺確實被包裹在了核的表面上。

2.5 穩定性 分別將體積分數為 0.10的 HCl、1 mol/L NaOH、20 g/L NaCl、體積分數為 0.95的C2H5OH等體積加入所制備的乳液中,振蕩,將所得乳液置于 4℃冰箱,800 h后觀察。沒有發現絮凝或沉淀,可判斷乳液體系穩定。

2.6 緩釋性能 采用動態滲析法測定熒光微球乳液中熒光素的釋放情況。精確稱取熒光微粒乳液 0.5 g,加入 30 ml雙蒸水及 20 ml pH=7.4的磷酸鹽緩沖液,攪拌后置于滲析袋內,滲析袋置于 500 ml pH=7.4的磷酸鹽緩沖液,將其置于 37℃恒溫箱中,100 r/min磁力攪拌,按時于 0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、32 h、64 h、100 h和 128 h,取 10 ml袋外磷酸鹽緩沖液進行熒光素含量測定,每次取樣后補加 10 ml磷酸鹽緩沖液。測得的熒光釋放曲線如圖 6。

圖6 核殼熒光微球的熒光釋放曲線Fig.6 Fluorescein release curve of core-shell fluorescent microsp here

2.7 載藥量及包封率測定 精密稱取適量制得的核殼結構熒光微球,置于 100 ml量瓶中,用 pH 6.8 PBS溶液溶解,超聲處理 10 min,稀釋至刻度,搖勻并靜置,經 0.45μm醋酸纖維素微孔濾膜濾過、備用。精密吸取濾液 2 ml置于 50 ml量瓶中,用上述 PBS溶液稀釋至刻度,搖勻,根據標準曲線方程計算藥物質量濃度,并按下式計算載藥量和包封率。

載藥量 =樣品中熒光素的質量/樣品量×100%;

包封率 =微粒中熒光素的質量/投藥量×100%。重復 3次測量所得的載藥量分別為24.37%、25.16%和 25.89%;包封率分別為91.25%、89.32%和 90.06%。

3 討 論

3.1 加料方式對實驗結果的影響 在半連續(饑餓態)加料實驗中,發現有部分不理想的核殼結構,而且體系黏度不斷增大,其產生的原因可能有 2點：①起始 AAM濃度已經足夠,之后加入的AAM溶液只增加體系中AAM的濃度,從而加快了 AAM的自聚,而對核表面的環境影響不大;②水溶性的 KPS引發劑從預處理步驟開始就一直分散在混合溶液中,在溫度升高之后導致溶液體系中丙烯酰胺的自聚,而不是在種子核表面聚合,導致體系黏度不斷增大。后加入的 AAM溶液會導致 AAM在溶液中形成聚丙烯酰胺,使體系濃度增大,從而影響了殼結構形成的理化環境。而且,半連續加料反應時間長,實驗操作工作量大,需要不斷的補充原料,從而導致實驗及工藝的可重復性差。這些都有可能給之后的工藝放大和工業化生產帶來極大的不便和障礙。

3.2 不同引發劑對實驗結果的影響 ①水溶性的 KPS引發劑從預處理步驟開始就一直分散在混合溶液中,在溫度升高之后導致溶液體系中丙烯酰胺的自聚,而不是在種子核表面聚合,導致體系黏度不斷增大;②油溶性的 A IBN引發劑在預處理過程中沒有分散在混合體系當中,而是由于其水溶性差的性質,在混合體系中均勻地分散在了種子微球表層的非極性物質當中,反應開始后,少量附著在微球表面及附近的AAM單體在 A IBN的作用下進行自由基聚合,然后體系中的丙烯酰胺不斷補充到微球表面,聚合反應繼續進行,從而使殼不斷加厚;③乙醇具有溶脹作用,可以把 A IBN和 AAM單體帶入微球表面甚至表面以下更深入的部位,有利于聚丙烯酰胺殼的形成。在水溶性體系及 AAM這種水溶性單體的環境下,要阻止 AAM單體在水相中聚合,使用 A IBN目前看來是很可行的方法。按照這個想法,如果使用一種如丙酮、四氯化碳的非極性溶劑來浸泡和溶脹種子微球,可以讓丙烯酰胺聚集到微球表面;從理論上來說,這可能會有較好的效果,但是存在工藝放大、工業化生產及實驗安全方面的問題。

3.3 交聯劑的使用 交聯劑使 AAM單體在引發劑的作用下形成了網狀結構,但網狀結構沒有象預想的那樣,能較好地附著在種子微球上,而更多的可能是在相互碰撞形成更大分子量的聚丙烯酰胺,造成 AAM單體在比單獨使用 KPS為引發劑的條件下更快地聚合,導致體系黏稠。

3.4 pH的調節 對比微球合成時的條件,分析可能原因：①制作種子核時,pH應調節在 6～7之間,否則無法成球,因此 pH在酸性條件下不利于保持微球的原始形態,反應時間長會使微球破裂、分散;②pH從機制上影響自由基產生的速率,并影響鏈延長過程中自由基的傳遞,從而影響整個聚合反應,所以合成效果遠不如控制 pH為中性時。

另外發現,KPS在分解形成自由基的過程中,會產生 H+,使 pH降低,在反應過程中 pH不斷變化,需要不斷地加入 NaOH才能使 pH保持穩定,而 A IBN在引發聚合反應的過程中不會改變體系 pH。因此使用 A IBN只需在加入AA之后調節一次 pH即可。

3.5 微球濃度的選擇 關于濃度對反應有影響的原因很顯然,AAM單體、A IBN的不足自然不會引起大量的殼結構形成,同時,個別很好的殼的存在,也說明了反應條件對于殼的形成還是很溫和、有利的。凝聚現象的產生則可能是因為原料濃度過低,在種子表面形成很薄而且不均一、不完整的薄殼,導致微球之間的互相黏合。而在半連續 (饑餓態)加料法的實驗中,也曾嘗試過反應過程中加 AAM溶液,根據多次反應過程中經驗性的效果,再加上種子微球來源單一,濃度穩定,因而摸索出了種子聚合的最佳濃度。

3.6 溶脹效果 因為溶脹的速度比較慢,需要浸泡比較長的時間才能使微球表面軟化,并使聚合單體與引發劑隨著乙醇溶劑緩慢附著、沉積、浸入微球表層。這樣,當溫度升高之后,丙烯酰胺聚合反應就可以在熒光素微球表面進行,這也正是形成殼所需要的效果。

4 結 論

本研究以乳液聚合得到的苯乙烯熒光素微球為核,以丙烯酰胺、丙烯酸為殼結構的聚合單體,對加料方式、引發劑選擇、交聯劑使用、pH調節、濃度配比和溶脹處理等反應條件對形成殼結構的效果以及形態學上的影響進行了研究。得到的最佳反應條件為：在不使用交聯劑的前提下以偶氮二異丁腈為引發劑,經過 40 h的乙醇溶脹處理,70℃下反應 3 h,反應過程中保持 pH值在 6～7之間。本研究最終制得的聚苯乙烯核-聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)殼熒光素微球具有良好的熒光性能和明顯的核殼結構,分散性和穩定性良好,粒徑均一且分布范圍為 7～8μm。該熒光微球載藥量和包封率也相對穩定,分別為 25.14%和 90.21%;并具有良好的緩釋性能,其熒光釋放率 40 h后穩定在 30%左右。這種核殼結構的熒光素微球有望在免疫檢測、蛋白標記等方面得到廣泛應用。

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Preparation method of polystyrene core-poly(acrylam ide-acrylic acid)shell fluorescent microspheres

YAOWan-xia1,2,YANGBiao3,L IQun3,SUN Yao-jie3
(1.The First Affliated Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061,China;2.School of Life Sciences and Technology,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710049,China;3.School of Information Science and Engineering,Fudan University,Shanghai 200433,China)

Objective：To investigate the p reparation method of polystyrene core-poly(acrylamide acrylic acid)shell fluorescent microspheres.Methods：The polystyrene core-poly(acrylamide-acrylic acid)shell(P-(St-co-AAM))fluorescent microspheres were prepared using fluorescent microspheres as the core and acrylamide/acrylic aspolymerization monomer.Reaction conditions affecting themorphology of core-shell structure including feedingmode,initiator,cross linker,pH,concentration and swelling were studied. Results：Fluorescent microscopy showed that the relatively uniform particle sizes weredistributed in a range of 7-8μm.Fourier transform infra-red spectroscopy(FT-IR)p roved the existence of poly(acrylamide-acrylic acid)shell and amide group on the surface.The optimal conditions for seeding polymerization：azobisisobutyronitrile was used as the initiator in the absence of cross linker,after a 40 h swelling treatment by using alcohol with the appropriate reaction temperature(70℃),reaction time(3 h)and pH(6-7). The average dispersion and stability were 25.14% and 90.21%,respectively.The fluorescein release percentage was kept stable at approximately 30% after 40 h.Conclusion：The fluorescent microspheres prepared by this method have core-shell structure and satisfactory fluorescence properties with good dispersion and stability.

Microspheres; Fluoresceins;Acrylamide/chem; Polystyrenes/chem; Polymers;Emulsions;Technology,pharmaceutical

TQ 460.6

A

1008-9292(2011)01-0044-07

http：∥www.journals.zju.edu.cn/med DO I：10.3785/j.issn.1008-9292.2011.01.009

2010-08-10

2010-11-24

西安交通大學第一醫院院基金(2006YK.25,2007YK.50)資助.

姚晚俠 (1962-),女,博士研究生,康復醫學;E-mail：yaowanxia@163.com

孫耀杰 (1969-),男,副教授,主要從事光電測試與控制技術研究;E-mail：yjsun@163.com

[責任編輯 黃曉花 ]