液相色譜串聯質譜法測定養殖水體中孔雀石綠及其代謝物

徐彥輝 顧 亮 蔣俊樹 丁 磊

(國家農副加工食品質量監督檢驗中心，安徽國家農業標準化與監測中心，合肥 230051)

孔雀石綠(MG)為三苯甲烷類工業染料，同時還是一種有效的殺滅霉菌的染料類藥物，對真菌和寄生蟲有較好的殺滅效果，在水產業得到了廣泛應用。孔雀石綠是3個芳香胺的聚合物，存在潛在致癌、致畸、致突變作用。自1980年發現孔雀石綠具有潛在的致癌性, 美國、日本以及英國等許多國家已禁止其用于水產養殖業。中華人民共和國農業行業標準NY5071-2002《無公害食品漁用藥物使用準則》中已將孔雀石綠列為禁用藥物。但是由于孔雀石綠效高價廉、管理力度不夠、替代品少等原因，使得不少漁民還在小范圍使用，這不可避免地帶來其在水產品中的殘留問題和環境污染問題[1]。有文獻報道孔雀石綠進入養殖水體后，除了進入魚體還會有一部分殘留在水中。另外，孔雀石綠作為工業染料而產生的廢水有可能通過相關渠道進入養殖水體系，污染水體。近年來我國因藥物殘留，出口的動物源性食品禁運現象經常發生。孔雀石綠作為一種禁用藥物，需要開發出一種靈敏可靠的檢測方法來監控其使用情況，這不僅局限于水產品本身，對養殖環境中的孔雀石綠的監控同樣極其重要。總之，隨著對水產品質量安全重視，對有害有毒物質的監控越來越多，要求也越來越嚴格，無論是從對孔雀石綠在水產品中使用的監控還是對養殖水體間接污染物的監測，都有必要建立一種水產養殖環境中孔雀石綠的檢測方法。

目前國內有關孔雀石綠的研究報道主要集中在水產品中，對養殖水體中的殘留檢測報道較少。筆者建立了一種簡便、高效、準確，適用于檢測水樣中痕量孔雀石綠及其代謝物的方法，為水產養殖環境提供可行的監測手段，同時可為水體中孔雀石綠檢測標準的制定提供依據。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜串聯質譜儀：6410 Triple Quad LC/MS型，美國安捷倫公司；

離心機： Z-323 K型，德國哈默公司；

超聲波清洗器：KQ5200 DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

混勻器： IKA MS 3basic，德國IKA公司；

甲醇、乙腈、乙酸、甲酸：色譜純，美國TEDIA公司；

顯性孔雀石綠(MG)和隱性孔雀石綠(LMG)標準儲備液：1 mg/L，用乙腈配制，根據需要用流動相將混合中間標準溶液稀釋成適合濃度的混合標準工作溶液，現配現用；

試驗用水為美國Milli-Q去離子水發生器制備的高純水。

1.2 樣品前處理

準確量取20 mL養殖水樣于50 mL具塞離心管中，以5 000 r/min離心5 min，除去部分雜質，將上清液轉移至另一50 mL具塞離心管中用乙酸調節至pH (3±0.2)，將酸化后的水樣全部轉移至已活化的PCX (60 mg,3 mL)固相萃取柱(使用前用3 mL乙腈，3 mL 2%甲酸水溶液活化)，控制流速不超過0.5 mL/min，將上清液全部過柱，依次用3 mL 2%甲酸水溶液淋洗、3 mL 水淋洗，棄去淋洗液并將小柱抽干，用3 mL乙酸乙酯-甲醇-氨水(體積比為50∶45∶5)洗脫，收集洗脫液于50℃水浴中氮氣吹干，準確加入1 mL流動相，渦旋混勻30 s后，經0.22 μm濾膜后供儀器檢測。

1.3 儀器分析條件

(1)液相色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm)；柱溫：35℃；流速：0.30 mL/min；進樣量：5 μL；流動相：5 mmol/L乙酸銨-乙腈(體積比3∶1)，等度洗脫。

(2)質譜分析條件

離子源：電噴霧離子源(ESI+)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化器壓力：276 kPa (40 Psi)；毛細管電壓：3 500 V；碰撞電壓以及相應的定性離子對、定量離子對、保留時間及碰撞能量見表1。

表1 多反應監測(MRM)條件

2 結果與討論

實驗研究對象為養殖水樣，成分相對簡單，油脂、色素含量較少，因此實驗省去了相關國家標準中先使用中性氧化鋁除脂步驟，而選擇了將養殖水樣離心后采用固相萃取方法，富集水樣中的孔雀石綠供色譜分析。為了選擇合適的固相萃取條件，要分析研究對象的相關性質。孔雀石綠在水體中有顯性孔雀石綠和隱性孔雀石綠兩種存在形式。顯性孔雀石綠為極性物質，易溶于水，在水體中多以陽離子形式存在，而隱性孔雀石綠極性較弱，易溶于有機溶劑[2]。結合目標物有不同的極性,實驗選擇了混合陽離子固相萃取柱(PCX)，它兼有陽離子交換和反相萃取性質，適合本實驗中目標物的富集分析。

孔雀石綠對光、熱和氧氣較敏感，易發生去甲基化和氧化降解，且孔雀石綠(pKa=6.9)分子結構中有兩個氨基，在酸性條件下易形成陽離子，結合固相萃取條件的優化可知pH值在實驗中是關鍵因素，影響到富集和洗脫的效果。因此實驗重點將pH值對實驗的影響進行了研究探討。

2.1 不同酸性條件下的回收率

孔雀石綠的pKa=6.9，根據陽離子固相萃取條件的選擇，為了保證上樣時孔雀石綠帶上正電荷，理論上pH值要小于pKa兩個單位以上[3]。試驗比較不同pH值為3、4、5、6.7條件下孔雀石綠的回收率。從試驗結果可知，隨pH值的增大，孔雀石綠的回收率降低，這可能是孔雀石綠在不同酸性條件下形成陽離子的能力差異影響到了固相萃取效果。實驗最終選擇了使用乙酸調節養殖水樣至pH 3，在此酸性條件下孔雀石綠的回收率最高。

2.2 洗脫溶劑的選擇

固相萃取條件優化過程中，洗脫液的選擇至關重要。同樣根據陽離子固相萃取條件的選擇，為了保證洗脫時中和孔雀石綠所帶電荷，理論上pH值要大于pKa兩個單位。在參考相關文獻[4,5]的基礎上，首先選擇了氨水甲醇作為洗脫液，研究發現不同濃度(1%、2%、3%、4%、5%)的氨水甲醇溶液的回收率不高，因此又對洗脫液進行了優化，研究發現加入一定量的乙酸乙酯后，孔雀石綠的回收率達到了70%以上。對不同濃度的乙酸乙酯-甲醇-氨水(體積比50∶49∶1、50∶48∶2、50∶47∶3、50∶46∶4、50∶45∶5)的回收試驗表明，乙酸乙酯-甲醇-氨水的體積比為50∶45∶5時回收率最高。

2.3 儀器條件的選擇

在LC-MS/MS分析中，色譜的分離和質譜數據的采集是同時進行的。為了使每個組分都得到分離和鑒定，以獲得最大的靈敏度，必須設置合適的色質分析條件，特別是質譜條件。

色譜條件包括色譜柱類型、流動相組成、流動相大小、柱溫等。質譜條件包括離子源、離子化模式、離子源溫度、霧化氣流量、質量掃描范圍、定量檢測模式等，這些都要根據樣品情況進行設定，優化的儀器分析條件見1.3。

2.4 線性關系與檢出限

在優化的測定條件下，配制系列不同濃度的混合標準溶液進行測定，以各組分定量離子的峰面積對濃度繪制標準曲線，線性關系和相關系數見表2。

表2 顯性和隱性孔雀石綠樣品的檢出限和線性關系

由表2可見，在0.5～50 μg/L濃度范圍內，MG、LMG質量濃度和定量離子峰面積呈良好的線性關系。MG和LMG的儀器檢出限均為0.5 μg/L。

2.5 回收率與精密度

采用在空白樣品中添加標準溶液的方法，分別對2種不同水樣中孔雀石綠(MG和LMG)進行 3個水平的添加回收試驗，每個水平進行 6次重復試驗，測定結果的相對標準偏差為1.9%～9.6%，回收率為71.5%～88.0%，試驗結果見表3。

表3 精密度和回收試驗結果 (n=6)

3 結語

建立了液相色譜-串聯質譜法測定養殖水樣中顯性孔雀石綠和隱性孔雀石綠殘留量的方法。該法具有快速、靈敏、準確和操作簡單的特點，各項技術指標均滿足國內外對孔雀石綠殘留檢測標準的要求。

[1] 張彤晴，楊洪生，林海，等.高效液相色譜法測定養殖水體中孔雀石綠和無色孔雀石綠[J].水產學報, 2007,5(31):609-703.

[2] Kamila Mitrowska, Andrzej Posyniak, Jan Zmudzki. Determination of malachite green and leucmalachite green residues in water using liquid chromatography with visible and fluorescence detection and confirmation by tandem mass spcetrometry[J]. Journal of Chromatography A,2008,1 207(1):94-100.

[3] safark I, Safarikova M. Detection of low concentrations of malachite green and crystal violet in water[J]. Water research, 2008,36:196-200.