葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒的制備及其特性研究＊

李宏良 田華琴 梁貴文 黃小青 陳學彰 王 斌 楊耀林

廣東省佛山市中醫醫院腫瘤血液科(佛山 528000）

葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒的制備及其特性研究＊

李宏良 田華琴△梁貴文 黃小青 陳學彰 王 斌 楊耀林

廣東省佛山市中醫醫院腫瘤血液科(佛山 528000）

目的:制備葉酸偶聯殼聚糖載華蟾素納米粒,并檢測其體外性質。方法:首先合成葉酸偶聯殼聚糖,再制備負載華蟾素的葉酸偶聯殼聚糖納米粒,并測定葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒的載藥量、包封率及累積釋藥量。結果:制備了葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒,載藥量為9.7%,包封率為61.3%,12h累積釋藥量為42.6%,72h累積釋藥量為63.3%。結論:葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒制備工藝簡單,性能較好。

華蟾素(Cinobufacini）注射劑是傳統中藥中華大蟾蜍皮的水制劑,其成分為吲哚生物堿,具有抑制腫瘤生長和刺激免疫系統的雙重作用,臨床廣泛用于腫瘤的治療。但華蟾素存在導致嚴重的靜脈炎等不良反應[1],限制了藥物的劑量。為了減輕其不良反應,并提高其抗腫瘤的療效,本文選擇具有減輕化療藥物毒性的殼聚糖(chitosan,CTS）為載體,偶聯具有腫瘤靶向的藥物——葉酸(FA）,制備負載華蟾素的葉酸偶聯殼聚糖納米粒,同時對其體外性質進行檢測。

1材料與儀器1.1 材料 殼聚糖(CTS,濟南海得貝海洋生物工程有限公司,脫乙酰度＞90%）,多聚磷酸鈉(TPP,國藥集團化學試劑有限公司）,葉酸(FA,Sigma公司）,華蟾素(安徽金蟾生化股份有限公司,081005-1）,5-羥色胺對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:111656-200401）,1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺(EDC,Sigma公司）,無水二甲基亞砜(DMSO,國產分析純）。

1.2 儀器 78-1磁力加熱攪拌器(中國江蘇）,冷凍干燥機(德國Lab）,H-600透射電鏡(HITACHI）,ZetaSizer3000HS激光粒度分析儀(英國Malvem 公司）,UV-265FW 型紫外分光光度計(日本島津）、AVantiTM30低溫超速離心機(美國）、熒光顯微鏡(美國Model550）,酶標儀(德國Leica）。

2方法和結果2.1 葉酸偶聯殼聚糖的制備及純化 參照文獻[2],稱取葉酸(FA）300mg、EDC260mg,溶于15mL無水DMSO中,室溫避光磁力攪拌1h至FA全部溶解。加入5mg/mLCTS醋酸水溶液(pH4.7）30mL,室溫避光磁力攪拌過夜。用NaOH調節溶液pH至9.0。用PBS液透析3d,再用雙蒸水透析3d。冷凍干燥得淡黃色粉末。

2.2葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒制備 取6mg葉酸偶聯殼聚糖納米粒溶于5mL1%醋酸溶液中,用NaOH調節pH至5.0,磁力攪拌,并逐滴滴加適量的華蟾素,然后往攪拌的溶液中滴加2mL0.6mg/mLTPP溶液,磁力攪拌30min。將所得溶液雙蒸水透析24h,冰浴超聲分散30min,過0.45um濾膜,即得載藥納米粒。

2.3 葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒的形態學特征及粒徑測量 取納米粒液適量,滴至鋪有碳膜的銅網上,靜置1min,用2%磷鎢酸負染6min,在透射電鏡下觀察形態和大小。另取納米粒溶液用激光衍射粒度分析儀測定平均粒徑及粒徑分布。結果顯示透射電鏡觀察可見球形納米微粒,粒子形狀規則,大小均勻,無粘連。實驗測得葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒的平均粒徑為213.7nm。

2.4 載藥量、包封率和累計釋放度的測定 2.4.1華蟾素標準曲線的制備:精密稱取5-羥色胺對照品10mg,置50mL量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。精密量取對照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分別置10mL量瓶中,加水使成5mL,搖勻,加15%對二甲氨基苯甲醛濃鹽酸溶液(2→3）至刻度,搖勻,室溫放置30min,照分光光度法(《中國藥典》2005版第一部附錄28）,以水為空白,在555nm波長處分別測定吸收度(A）,以A為縱坐標,濃度(C）為橫坐標,繪制標準曲線。其回歸方程為:A=0.0074C-0.0896(r=0.9997）,表明 5-羥色胺在 22.3～ 115.2μg/mL 范圍內呈良好的線性關系。

2.4.2 葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒包封率及栽藥量的測定:將制備的載藥納米粒動態透析72h,期間換透析介質水3次,除去黏附未包裹的華蟾素,透析后冷凍干燥。精密稱取純化后葉酸偶聯殼聚糖載藥納米球約50mg,置于100mL燒瓶中,加0.1mol/L鹽酸溶液50mL,60℃水浴回流3h使納米球完全溶解,放冷,定容,過濾,取濾液1mL稀釋至10mL,于555nm處測定吸光度。按標準曲線計算游離華蟾素的量,并計算包封率和載藥量。結果測得包封率為61.3%,載藥量為9.7%。

2.4.3 葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒體外釋藥的考察:精密稱取凍干后的載藥納米粒5.0mg,溶于1mL磷酸緩沖液(PBS,pH7.4）,取50μL置于微量透析管,懸浮于25mL離心管內,于離心管中加入20mL的磷酸緩沖液(PBS,pH7.4）,將其置水浴振蕩器中(溫度37℃,振蕩頻率為100次/min）。分別于第4、8、12、16、20、24、48、72h 取透析袋外 PBS2mL,在555nm處測定吸光度,同時補回等量的釋放遞質。根據標準曲線方程,計算其濃度和累積釋放量,取3次實驗的平均值,以累積釋藥百分率對時間作圖,繪制載藥納米粒的釋放曲線。華蟾素在各時間點的累積釋放百分率(Q）計算公式為:

式中V0為釋放遞質的總體積,V為每次取樣體積,Ct為各時間點測得釋放介質中的華蟾素濃度(mg·mL-1）,M 為投入的華蟾素納米粒的質量(mg）,X為測得華蟾素納米粒的載藥量(%）。葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒的釋藥曲線見突釋和緩釋兩個階段,突釋階段于12h累積釋藥量為42.6%,緩釋階段于72h累積釋藥量為63.3%。見圖1。

圖1 葉酸偶聯華蟾素殼聚糖納米粒的釋藥曲線

3討 論

殼聚糖(CS）是天然生物大分子甲殼素脫乙酰基而得到的堿性多糖,其化學穩定性良好,既有良好的生物相容性及生物可降解性,又有增強機體免疫功能的效應,以殼聚糖包封化療藥物可有效降低其毒性,同時本身也具有一定的抗腫瘤作用[3]。

惡性腫瘤細胞膜表面葉酸受體(FR）的數量及活性顯著高于正常細胞。葉酸具有免疫原性低、易于修飾、易穿透腫瘤、到達靶點時間短、血液清除快、穩定性高、成本低、易貯存等優點。葉酸對葉酸受體的親和力比單克隆抗體對腫瘤細胞表面的受體的親和力強100倍以上。利用葉酸受體在某些腫瘤部位的過度表達而在正常組織低水平表達的特性可以實現葉酸偶聯藥物的腫瘤靶向輸送。因此,葉酸靶向可成為增加化療藥物對腫瘤細胞敏感性的新途徑[4]。

本文選擇殼聚糖(chitosan,CS）為華蟾素的載體,利用葉酸活性酯與殼聚糖分子上的氨基反應形成穩定的酰胺鍵,制備葉酸偶聯殼聚糖,利用殼聚糖在偏酸性溶液中帶正電荷,在高速磁力攪拌作用下能與陰離子凝集的特性,制備負載華蟾素的葉酸偶聯殼聚糖納米粒,測得載藥量為9.7%,包封率為61.3%,12h累積釋藥量為42.6%,72h累積釋藥量為63.3%。該制備工藝簡單,性能較好。下一步我們將進行體外實驗及動物實驗評價其腫瘤細胞靶向性及不良反應。

[1] 龔愛平,劉金秀,倪 蓓,等.華蟾素的不良反應(附201例臨床觀察）[J].徐州醫學院學報,1998,18(5）:418-420.

[2] 龔金蘭.汪森明.胡喜鋼,等.腫瘤靶向性藥物載體葉酸殼聚糖微球的制備及特性研究[J].南方醫科大學學報,2008,28(12）:2183-2186.

[3] Hejazi R , Amiji M. Chito san-based gastro in testinal delivery system [J ]. J Control Release, 2003, 89 (2） : 151-165.

[4] Low PS, Antony A C. Folaterecep tor-targeted drugs for cancer and inflamm atory diseases[J ]. Adv Drug Rev, 2004,56: 1055-1058.

華蟾素/生產和制備 工藝,藥學 納米

R285

A

1000-7369(2011）05-0610-03

＊佛山市科技局醫學類科技攻關項目(佛科[2007]29號）

△通迅作者。

(收稿2010-09-03;修回2010-10-09）