玫瑰花環抑制實驗檢測肉牛早孕因子(EPF)活性

賀加雙,馬衛明,鄧立新,宋移福,劉蓮蓮,曹永芝,謝 冰

(1.山東農業大學動物科技學院,山東泰安 271018;2.河南農業大學牧醫工程學院,河南鄭州 450002)

早孕因子是哺乳動物受精后最早在血清中檢測到的具有免疫抑制和生長調節作用的妊娠相關蛋白。它是一種免疫抑制因子和生長因子,1974年由澳大利亞學者Morton等[1]在孕鼠血清中首次發現,由于在小鼠受精6 h后就可檢測到,因此被命名為早孕因子。此后,在妊娠婦女[2]、羊[3]、豬[4]、牛[5]等妊娠哺乳動物母體內相繼檢測到了EPF。目前普遍認為EPF是熱激蛋白家族成員—伴侶蛋白10(Cpn-10)的同系物[6,7],是最早確認妊娠的生化標志之一,是防止母體對胚胎乃至胎兒發生免疫排斥反應的必需物質[8]。由于它能增強抗淋巴細胞血清抑制 T淋巴細胞花環形成,可用花環抑制試驗做生物學鑒定。在牛授精后盡早對其做妊娠診斷可以避免空懷,胚胎死亡后早孕因子會迅速下降,因此監測早孕因子活性對肉牛產業意義重大,由于早孕因子在超早期妊娠診斷,腫瘤病的診斷,胚胎監測,治療實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎[9,10],流產預測等方面具有潛在的應用價值,因此成為研究的重點。

1 材料與方法

1.1 血樣的采集與處理

肉牛血樣采自山東省鄄城縣魯西黃牛保種繁殖基地。頸靜脈采血取11頭不同孕期孕牛(孕期1～2月5頭,3～5月4頭,6～9月2頭)和4頭未懷孕肉牛血液做對照。該15頭牛體重相當,營養狀況和飼喂條件均一致。2 500 r/min離心20 min,分離血清,并在56℃下鈍化 30 min,分裝,-20℃保存備用。采樣時已做妊娠診斷。

1.2 牛外周血淋巴細胞懸液的制備

采集健康肉牛血液,0.1%肝素鈉抗凝。加入等體積pH 7.4的PBS液,混勻,按每管4 mL輕輕疊加于盛有等量牛淋巴細胞分離液(D=1.086)的10 mL離心管中。2 000 r/min離心15 min。離心結束后,吸取分離液與血漿交界部位的灰白云霧層,用3倍體積的PBS液以2 500 r/min離心20 min。棄上清,沉淀洗滌2次,取l滴細胞懸液,用臺盼蘭拒染法鏡檢計數細胞,最后將細胞調整到2×106個/ mL,備用,并3 h內使用。

1.3 綿羊紅細胞(SRBC)的制備

綿羊頸靜脈采血,0.1%肝素鈉抗凝,2 500 r/min離心15 min分離紅細胞。用PBS液洗5次,配成終濃度為1.5%。4℃保存備用。

1.4 玫瑰花環形成率檢測

孕牛血清倍比稀釋成終體積為100 μ L。加等體積的淋巴細胞,37℃孵育 60 min,加 100 μ L 1.5%的綿羊紅細胞,37℃孵育5 min,2000 r/min離心2 min,室溫孵育40 min,輕輕重懸,20 μ L 10%的戊二醛固定,涂片,瑞氏染色,鏡檢。計數淋巴細胞和紅細胞形成的花環結構。結合紅細胞少于3個的不計入。花環抑制滴度(RIT值)按花環數低于對照組75%的最高血清稀釋倍數的對數計算。

1.5 數據分析

數據分析采用SPSS。

2 結果

2.1 玫瑰花環抑制滴度

懷孕1～9月肉牛玫瑰花環抑制滴度是8～10,而對照組花環滴度為3,顯著高于對照組,因此按此法做玫瑰花環抑制試驗檢測肉牛的早孕因子活性,可以認為滴度高于8為懷孕狀態(見表1)。

表1 不同孕期肉牛玫瑰花換抑制滴度(RIT值)

2.2 玫瑰花環形成情況

2.2.1 對照組 能形成完整的玫瑰花環,結合紅細胞多,花環形成率高。詳見圖1,圖2。

2.2.2 懷孕牛組 淋巴細胞結合紅細胞少,花環不完整,花環形成率低,詳見圖3,圖4。

圖 1

圖2

圖 3

圖4

3 討論

隨著生物技術在畜牧生產中的應用,超早期妊娠診斷、評價胚胎的存活及其活力、分析早期胚胎丟失的原因等顯得尤為重要。EPF的發現為其提供了可能,通過Ea玫瑰花環形成抑制試驗,測定RIT值判別其存在與否,是目前對EPF的檢測的唯一方法,該方法一般需要制備抗淋巴細胞白蛋白(ALS),檢測ALS的最大稀釋倍數[11,12],用以計算RIT值。方法繁瑣,靈敏度差。本試驗建立檢測抗淋巴血清的最大稀釋倍數來計算RIT值的方法,對試驗步驟進行了簡化,宜于操作,簡單可行。

EPF對妊娠母體具有很高的特異性。一旦妊娠終止,血清中EPF立即消失。通過本實驗,觀察到妊娠牛玫瑰花環抑制滴度顯著高于對照組未妊娠牛,是對照組的2倍多。在本實驗中,玫瑰花環率高于8可以確認牛懷孕,低于4可以認為未懷孕。因此使用此法早期確認牛是否懷孕是可行的。由于牛胚胎死亡以后,EPF含量迅速減少,所以也可以用來檢測胚胎狀態。

淋巴細胞和孕牛血清孵育之后,形成的玫瑰花環結合的紅細胞減少,可能是淋巴細胞和EPF作用時,影響到牛T細胞膜上具有能和綿羊紅細胞膜上的糖蛋白相結合的受體。

由于玫瑰花環抑制試驗需要的藥品試劑多,操作程序繁瑣,在生產中的大規模推廣受到了一定的限制,可以通過制備EPF單克隆抗體、多克隆抗體等手段,作出快速診斷試劑或試紙,則可直接檢測 ,將為肉牛,乃至哺乳動物的早期、超早期妊娠診斷開創新的途徑。

4 結論

本試驗使用的檢測抗淋巴血清的最大稀釋倍數來計算RIT值的方法,對試驗步驟進行了簡化,宜于操作,效果確實。

在本實驗發現,玫瑰花環抑制滴度高于8可以確認牛懷孕,低于4可以認為未懷孕。因此使用此法早期確認牛是否懷孕具有可行性。

[1] Morton H,Hegh V,Chunie G.Immunosuppression detected in pregnant mice by the rosette inhibition test.Nature,1974,249 (456):459.

[2] Morton H,Rolfe B E,Cavanagh A C.Early pregnancy factor [J].Semin Reprod Endocrinol,1992,10:72-82.

[3] A thanasas-Platsis S,Morton H,Dunglison G F,et al.Antibodies to early pregnancy factor retard embryonic development in mice in vivo[J].J Reprod Fertil,1991,92:443-51.

[4] Athanasas-Platsis S,Corcoran C,Kaye P,et al.Early pregnancy factor is required at two important stages of embryonic development in the mouse[J].AJRI,2000,43:223-33.

[5] Noonan F P,Halliday W J.M orton Clunnie GIA:Early pregnancy facto r is immunosuppressive[J].Nature,1979,278:649-651.

[6] Esnglebretsen D R,Gamham B,Alewood P F.A cassette 1igation strategy with thioether replacenebt of three Ghy-Gly peptide bonds:total chemical sy nthesis of the lOl residue protein early pregnancy factor[psi(CH2S)28-29,56-57,76-77].J 0rg Chem.2002,67(17):5883.

[7] F1etcher B H,Cassad A I,Summers K M,et al.The murine chaperonin 10 gene fami1y contains an intronless,putative gene for early pregnancy facto r,Cpnl0-rs1.Mamm Genome,2001,12 (2):133.

[8] Clara Aranha,Arvind Bordekar,Savitri,et al.Isolation and purification of an early pregnancy factor-like molecule from culture supernatants obtained from lymphocy tes of pregnant women[J].Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1998,(15):619-624.

[9] Jacqueline Harness,Alice Cavanagh,Halle M orton,et al.A protective effect of early pregnancy factor on experimental autoimmune encephalomyelitis induced in Lewis rats by inoculation with myelin basic protein[J].Journal of the Neurological Sciences,2003,216:33-41.

[10] Zhang B,Harness J,Somodevilla-Torres M J,et al.Early pregnancy factor suppresses experimental autoimmune encephalomyelitis induced in Lewis rats with myelin basic protein and in SJL/J mice with myelin proteolipid protein peptide[J].Neurol Sci,2000,182(1):5-15.

[11] 孫文東,張 堅,趙麗霞,等.早孕因子生物學活性的研究現狀和應用前景[J].中華臨床醫藥,2004,5(17):56-58.

[12] 權 凱 ,張改平.應用 Ea玫瑰花環抑制試驗檢測奶牛血清EPF活性[J].中國奶牛,2008,26(6):29-31.