濕地松猝倒病拮抗細菌的篩選與定殖1)

霍憲起

(臨沂大學，臨沂，276005)

濕地松猝倒病拮抗細菌的篩選與定殖1)

霍憲起

(臨沂大學，臨沂，276005)

通過平板對峙培養，從320株分離于濕地松根部的拮抗細菌中篩選出27株對濕地松猝倒病病原菌有拮抗作用的菌株，再結合抑菌指數測定，進一步篩選出了抑菌作用最強的10株拮抗細菌。經16S rDNA分子測序方法鑒定，B4、C4、C23、C25、C28、C33、C41為洋蔥伯克霍爾德菌，C3和 C8為枯草芽孢桿菌，C27無法測定全部序列有待其它細菌鑒定方法確定其分類地位。在室內防病試驗時，B4和C41表現出顯著的防病效果，但在室外，C23表現出顯著的防病效果。10個菌株都可在濕地松根部定殖，但是在松苗根部不同部位的分布并沒有規律。定殖過程中，各個菌株在松苗根部的菌量隨著時間的增長而增加，在某一時刻達到峰值后數量逐漸減少。

濕地松;猝倒病;拮抗;細菌

濕地松(Pinus elliottii Engelm)是裸子植物門松屬的多年生常綠喬木，于20世紀30年代由美國引入我國。因其蒼勁而速生、適應性強、產脂量高，在我國山東平邑以南的園林、自然風景區和山區廣泛種植[1]。但是經常于濕地松育苗期發生猝倒病，嚴重影響濕地松育苗工作的正常進行。國內外資料顯示，濕地松猝倒病主要是由絲核菌(Rhizoctonia)、鐮刀菌(Fusarium)、鏈格孢菌(Alternaria)、腐霉菌(Pythium)等屬的多種真菌引起，且不同地區導致發病的病原菌種類不盡相同[2-4]。由于該病害病原菌寄主廣泛，在土壤中普遍存在，且對選擇性殺菌劑易產生抗藥性，因此濕地松猝倒病仍然是目前濕地松育苗期的主要病害之一。為了可持續地防治濕地松猝倒病，避免其病原菌因單一的化學防治而過快地產生抗藥性，生物防治已成為濕地松猝倒病防治的重要研究領域。筆者曾對國外分離到的熒光假單胞菌防治濕地松猝倒病的情況進行過報道[5]，本研究對從國內濕地松根系中分離到的拮抗細菌進行了鑒定，并對其在濕地松根際的定殖進行了研究，以期為濕地松猝倒病的生物防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

濕地松猝倒病病原菌絲核菌ZJ31、鏈格孢菌ZJ11和鐮刀菌ZJ36，均由筆者從發病的濕地松幼苗根頸處分離得到，絲核菌B為南京林業大學森林病理實驗室提供。濕地松猝倒病拮抗細菌320個，采用平板稀釋法[6]191分離自濕地松根際，根據采樣時間和地點依次編號為A1-160、B1-21、C1-45、D1-25、E1-11、F1-16、G1-18、H1-9、I1-15。除 C1-C22 分離自松滋濕地松苗圃外，其它均分離自荊門市彭場林場濕地松苗圃。大腸桿菌DH5α為中國農業科學院鄭州果樹研究所古勤生博士提供。濕地松種子由彭場林場種子園提供。引物由北京三博遠志公司合成:上游5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′;下游 5′-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3′。Taq DNA聚合酶為GIBCO公司產品，T4 DNA連接酶、蛋白酶為KNEB公司產品，pMD-18T為TaKaRa公司產品，dNTP為Promega公司產品，PCR產物純化試劑盒為Bio 101公司產品。病原真菌的保存、活化和培養用PDA培養基。平皿拮抗測定用1/2PDA+培養基[5]。拮抗菌的培養、活化和培養用 LB培養基[6]188。拮抗菌抗利福平突變體的分離、培養和檢測用LB+培養基(其他成分不變，在倒平板時另加利福平，質量濃度為3.0×10-4g/L)。

1.2 方法

拮抗細菌的初步篩選:病原真菌培養5d，取直徑8mm菌塊置于1/2PDA+平皿中央，培養24h。拮抗細菌在LB液體培養基中振蕩培養24～72h，至渾濁，取10μL滴于1/2PDA+平板上，每皿對角線接種，菌液與平皿中央等距，培養5d，觀察效果。25℃，黑暗培養。拮抗性強弱的劃分標準為，①無拮抗性。真菌覆蓋全部細菌;②弱拮抗性。至少一種真菌包圍細菌，但是細菌上無真菌;③中拮抗性。至少一種真菌的邊緣與近真菌端細菌接觸，但遠真菌端未接觸;④強拮抗性。至少一種真菌邊緣與近真菌端細菌未接觸。

細菌拮抗性定量測定:拮抗細菌抗性的測定參照文獻[5]進行。

拮抗細菌的分子鑒定:選擇強拮抗性的菌株進行分子鑒定。拮抗細菌基因組DNA通過CTAB法[7]提取，基因組16S rRNA擴增與擴增條件參照文獻[8]進行，大腸桿菌感受態細胞通過氯化鈣法[9]209制備，質粒 DNA 通過堿裂解法[9]115-116提取，目標片段的質粒測序后送 GenBank進行對比，用 DNAMAN 4.0(Lynnon Biosoft)分析，確定細菌分類地位。鑒定標準:所測序列與GenBank中的參比菌株的16S rDNA序列同源性不小于99％的為同一個種，與參比菌株的16S rDNA序列同源性不小于97％的為同一個屬[10]。

拮抗細菌抗利福平突變體的誘導:根據參考文獻[11]的方法對10個拮抗菌株進行抗利福平誘導，直到篩選到穩定的抗利福平300×10-6g/L的菌株突變體。觀察10個菌株突變體的培養性狀，并測定各個突變體在平板上對松苗猝倒病病原菌的拮抗效果，計算各個菌株的抑菌率。

拮抗細菌的防病試驗:拮抗菌防病試驗參照文獻[5]進行。

拮抗細菌的根部定殖:對濕地松種子催芽，待根長1～2cm時，接種細菌菌株，然后將幼苗于種芽間剪斷。根段置于裝有10mL蒸餾水的三角瓶(內置少量玻璃珠)中振蕩25min，然后將菌液稀釋至10-5涂平皿，每皿200μL菌液，4次重復，25℃恒溫培養4d，細菌計數，統計結果。根段稱鮮質量，計算初始菌量。用菌液浸泡濕地松幼苗后植入裝有滅菌土的塑料花盆中，在濕地松的莖木質化前分別于15、30、45、60、75d及木質化后的90d取樣，檢測細菌在根際的密度，以不接菌作為對照。每缽中取松苗10株，以根頸處為起點，按1cm一段截取，直至根尖，將相同根段置于裝有無菌磷酸緩沖液(PSB，pH值7.0)的三角瓶中，振蕩30min，稀釋涂平皿。1～10、11～20、21～30mm 根段用 10-5涂皿，其余根段用 10-4涂皿，稱出根段鮮質量，最后計數并統計結果。

數據分析:用軟件SPSS17.0對測定數據進行處理，并計算差異顯著性(鄧肯法)。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選

經過篩選獲得27株具有拮抗活性的細菌菌株，其中12株具有弱拮抗性，5株具有中拮抗性，10株具有強拮抗性，其余無拮抗性。強拮抗性菌株分別為:B4、C3、C4、C8、C23、C25、C27、C28、C33和C41(圖1)。由于10株細菌具有非常明顯的生防潛力，因此對它們全部進行16S rDNA的序列測定以確定其分類地位，并進行防病和根部定殖試驗。

圖1 濕地松猝倒病拮抗細菌的篩選

2.2 拮抗細菌的定量測定

對于鐮刀菌，T=0.7時，C28的拮抗能力最強，抑制指數為0.24，其次為C25 和 B4，抑制指數分別為0.22 和 0.17，并且3個菌株的拮抗能力在同一水平，差異不顯著，最弱的為C4;T=1時，除了 B4和 C41抑制指數分別為0.11和0.12外，其余8個菌的抑制指數均為0。對于鏈格孢菌，拮抗活性最強的為C23，T=0.7時抑制指數達 0.26，T=1時抑制指數為0.19;較弱的為C3和C4，在T=0.7時，2個菌株抑制指數分別為0.05和0.07，T=1 時，2 菌的抑制指數均為0，與其它8個拮抗菌株的差異極顯著。對絲核菌ZJ31，拮抗活性最強的為C23，其次為C28和C25，較弱的為C4和C8，無論T=0.7還是T=1，抑制指數均顯著低于其它8個拮抗菌株。對于絲核菌B，拮抗活性較強的為C23和C33，較弱的為C3、C4和C27。總體看來，10個拮抗菌株對鏈格孢菌和絲核菌的拮抗能力相對較強，對鐮刀菌的拮抗能力都相對較弱。C23對鏈格孢菌和絲核菌表現出很好的抗性，但對鐮刀菌表現出的抗性較差;B4和C41對4個供試病原菌均表現出一定的拮抗效果;C4對4種病原菌的拮抗效果均較差，特別是對于鐮刀菌和鏈格孢菌幾乎沒有拮抗作用(表1)。

室內對峙試驗的分析表明，供試拮抗菌中C23對松苗猝倒病病原菌中的絲核菌和鏈格孢菌有顯著的拮抗作用，但對鐮刀菌拮抗效果不明顯;B4和C41對4個供試病原菌均表現出一定的拮抗效果，而C4幾乎對所有病原菌拮抗效果都不明顯。

2.3 拮抗細菌16S rDNA序列測定

根據16S rDNA 鑒定細菌的標準，鑒定 B4、C4、C23、C25、C28、C33、C41為洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia);C3和C8為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);C27菌株可能存在著復雜的高級結構，無法精確地測定出其16S rDNA的全部序列，有待于用另外的細菌鑒定手段進行鑒定(表2)。

2.4 拮抗細菌抗利福平突變體的誘導

觀察10個拮抗菌株抗利福平突變體的培養性狀，及各個突變體在平板中對松苗猝倒病病原菌的拮抗效果，各個菌株突變體與原始菌株培養性狀基本相同，計算抑菌率亦無顯著差異。以抗利福平突變體進行濕地松體內拮抗菌株的定殖檢 測是可行的。

表1 拮抗菌抑制指數的多重比較結果

表2 生防菌株與其同源菌株的16S rDNA同源性及其堿基差異

2.5 拮抗細菌的防治試驗

室內防治試驗中，土壤為取自濕地松苗圃的未經滅菌的土。浸過供試拮抗菌的濕地松苗種植15d后，7種供試菌表現出一定的防病效果，用 B4、C4、C8、C23、C27、C33、C41 浸過的松苗成活率分別為87.3％、62.5％、60.5％、75.0％、65.4％、66.4％、84.3％，均大于對照的56.1％，其中B4和C41與對照差異極顯著。而用C3、C25和C28浸過的松苗成活率均小于對照，分別為54.7％、55.8％、52.2％(表3)。

表3 拮抗菌株浸根后的松苗種植15d的成活率 ％

室外防治試驗中，無論是否用菌液處理過成活率均不高，但用 B4、C3、C23、C27、C33、C41 處理過的濕地松幼苗成活率高于對照，其中C23與對照的差異性達到顯著水平。而C4、C8、C25、C28的成活率均低于對照，但差異性不顯著。

2.6 拮抗細菌在根際的定殖

2.6.1 各個菌株在濕地松苗根部不同根段的分布

在濕地松幼苗接種拮抗菌后的近1個月內，從根的不同部位均可分離到所接種的菌株。從表4可以看出:10個拮抗菌株都可在濕地松幼苗根部定殖，并隨著根的生長而擴展，但無規律。C3、C4、C28和C33在濕地松苗根基部的密度大于根尖部的密度，但差異不明顯。而 B4、C8、C23、C25、C27和C41在根尖的密度大于根基部密度，而C4、C23在根中間的密度大于根尖和根部的密度。

表4 定殖25d時各菌株在濕地松苗根部不同根段上的分布

2.6.2 各個菌株在濕地松苗根部的定殖動態

在3個月的試驗期內，10個拮抗菌株在濕地松幼苗根際的定殖密度差異很大，但定殖的動態基本相似，均是在定殖后菌群密度逐漸增加，并在達到某一峰值后逐漸下降。C25定殖時的初始菌密度為2.5×104CFU/g，15d時菌群密度略有下降(1.7×104CFU/g)，但隨后菌群密度逐漸增加，并在60d時達到峰值3.2×108CFU/g，然后又逐漸下降。C28的菌群密度變化趨勢與C25基本相同。B4、C4和C23的菌量密度峰值出現在第75天，C3、C25、C27、C28和C41的菌量密度峰值出現在第60天，而C8和C33的峰值出現在第45天(表5)。

表5 拮抗菌株在濕地松幼苗根際定殖的動態

3 討論

通過平皿拮抗試驗，從320個濕地松根際分離物中篩選出27株對濕地松猝倒病具有一定抑制效果和防治作用的菌株。其中12株具有弱拮抗性，5株具有中拮抗性，10株具有強拮抗性。經16S rDNA序列測定，10株強拮抗性菌株中，7株為洋蔥伯克霍爾德菌，2株為枯草芽孢桿菌，1株無法精確測定出16S rDNA的全部序列。洋蔥伯克霍爾德菌和枯草芽孢桿菌是當前國內外研究比較多且具有開發潛力的2種菌，已有研究人員利用枯草芽孢桿菌開發出生防藥劑，用于生產實踐。但是，利用洋蔥伯克霍爾德菌進行生物防治還處于試驗研究階段。

為了讓拮抗菌更好地附著于幼苗根部，用菌液浸泡后在無菌操作臺上晾3～5min，這個過程可能會造成濕地松幼苗失水，生命力下降，這可能是造成室內、室外防治試驗中，無論處理過的幼苗還是對照成活率都不高的原因。室內防治試驗中，B4和C41表現出相對較好的防治效果，與對照差異極顯著。但在室外防治試驗中，只有C23表現出顯著的防治效果，其它9個菌株的防治效果與對照相比差異不顯著。這可能與室內、外的試驗環境有關，室內防治試驗于實驗室內進行，溫度、濕度、光照比較穩定，且無不利的天氣情況影響;而室外試驗時，溫度、濕度、光照、風速變化較大，并且在試驗其間下過3次雨，沒有及時排水。

定殖試驗顯示，10個菌株均可以濕地松根際定殖，分布無規律，這與熒光假單胞菌在濕地松幼苗根際定殖時的結果相似[5]，但與哈茨木霉在辣椒根際定殖時總是根尖部位菌量最多不同[12]。在定殖前期，除C25和C28外，其余8個菌株在濕地松根部的密度均隨著時間的推移而增加，并在某一時間達到峰值后逐漸下降，這與褐球固氮菌YKT41和伯克霍爾德菌B418在小麥根際定殖時的規律相似[13]，但與B296在小麥根際定殖時數量逐漸減少不同[14]，這種菌量變化趨勢的不同可能與菌株本身、寄主、環境有關，具體原因有待于進一步的試驗來揭示。

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Screening and Colonization of Antagonistic Bacteria Against Damping-off of Slash Pine Seedlings

/Huo Xianqi(School of Life Sciences，Linyi University，Linyi 276005，P.R.China)//Journal of Northeast Forestry University.-2011，39(7).-86～88，119

Slash pine;Damping-off;Antagonism;Bacteria

S763.15;Q939.92

1)國家林業局“948”項目(2003-4-39);湖北省國際科技合作重點項目(2007CA022);國家外專局項目(Y20080327002)。

;霍憲起，男，1977年1月生，臨沂大學生命科學學院，講師。

2011年1月2日。

責任編輯:程 紅。

Twenty seven strains of bacteria with obviously antagonistic ability to pathogens of damping-off were screened out from 320 strains isolated from the soil near the roots of slash pine by the dual culture method.Then ten strains with strong antagonistic ability were selected out in accordance with the determination result of inhibition index.They were identified by 16S rDNA sequencing.Results show that seven isolates of B4，C4，C23，C25，C28，C33 and C41 are Burkholderia cepacia，two isolates of C3 and C8 are Bacillus subtilis，and C27 is an unknown species.B4 and C41 showed prominent control effects in the indoor experiment，while C23 showed a prominent control effect in the outdoor experiment.Ten strains could be colonized in the roots of slash pine，but the distribution of the ten strains was irregular in different parts of the root system.In the process of colonization，the quantity of the ten strains kept rising over time.At a certain hour，the amount of the ten antagonistic strains would reach a peak，then gradually reduced.