稀酸水解玉米秸稈兩步發酵聯產纖維素乙醇和氫氣＊

潘春梅,杏艷,樊耀亭

能源供應和環境保護是全球經濟實現可持續發展所面臨的兩個關鍵性問題[1],開發新型可再生清潔能源已迫在眉睫。在可再生能源中,以氫氣和乙醇為代表的生物能源備受世人關注。氫能是公認的清潔能源,其熱值高 (約為化石燃料的 3倍),燃燒后沒有污染物生成,已被大量地應用在航空航天、電動汽車和石油化工等行業領域[2];乙醇也是一種高效、潔凈、可再生的燃料及汽油添加劑,在生產使用的整個循環過程中可保持溫室氣體 CO2的平衡。通過微生物轉化生產乙醇和氫氣的厭氧發酵生物技術已成為生物質清潔能源研究中極具吸引力的新的熱點研究課題[3]。

目前,發酵法生產的乙醇主要來自糖類和淀粉發酵,生物制氫研究也主要局限于糖類、淀粉及其相應有機廢水的發酵。但從總體看,要依靠糖蜜和糧食淀粉作為原料來解決用量很大的能源問題顯然是不現實的[4],相比較而言,利用纖維素類生物質更具有發展前景。近年來,一些研究者正致力于通過生物發酵法轉化秸稈類生物質為乙醇或者氫氣的研究,例如Saha等[5]利用 0.75%稀硫酸預處理后,利用纖維素酶、β-葡萄糖苷酶,木聚糖酶和酯酶對小麥秸稈進行水解,乙醇產量達到 0.24 g/g(干秸稈);Carad等[6]利用蒸汽爆破技術在 190～240℃處理橄欖枝,最大乙醇產量達到 0.159 g/g;樊耀亭等[7-8]用稀鹽酸對玉米秸稈和麥草秸稈進行預處理后用于發酵產氫,其相應的產氫能力分別從 2.68 mL/g玉米秸稈和 0.2 mL/g麥草秸稈提高至 128 mL/g玉米秸稈和 76 mL/g麥草秸稈。目前制約生物質能源工業化的主要瓶頸是纖維質的水解效率和轉化效率不高、生產成本高,與化石燃料相比沒有優勢。秸稈纖維質水解產生的可溶性糖可用于發酵生產乙醇,但是乙醇發酵結束后,仍殘存有一定量未降解纖維殘渣和廢液,如直接排放,會對環境造成污染,同時也是對生物質資源的極大浪費。這些纖維殘渣和廢液有可能被混合產氫菌降解轉化為清潔能源氫氣,實現資源的有效利用,降低生產成本。故本研究嘗試以玉米秸稈的稀酸水解物為底物構建兩步發酵聯產乙醇和氫氣體系,系統考察了脫毒處理對玉米秸稈稀酸水解物發酵產乙醇產氫的影響,并探討了玉米秸稈降解產乙醇產氫的機理,取得了有意義的研究結果。

1 材料與方法

1.1 菌種

乙醇發酵菌種:嗜鞣管囊酵母Pachysolen tannophilusG21,由鄭州大學環境工程實驗室馴化保藏。

產氫菌:菌源為牛糞堆肥,取自鄭州市奶牛場。

1.2 原料

玉米秸稈:取自河南省鄭州市郊,包括風干的玉米秸稈和未完全風干的玉米秸稈,其總固體量 (TS)分別為 90.16%和 25.1%。玉米秸稈的主要成分為纖維素 39.1%,半纖維素 30.9%,木質素 8.65%,可溶性糖 73 mg/g TVS。

1.3 培養基

1.3.1 酵母斜面 /種子培養基 (g/L)

葡萄糖 15,木糖 5,胰蛋白胨 20,酵母膏 10,Mg-SO40.25,CaCl20.25,pH值 5.5,裝液量為 50 mL/250 mL三角瓶,115℃滅菌 20 min。

1.3.2 乙醇基本發酵培養基 (g/L)

秸稈 100,(NH4)2SO410,酵母膏 1,蛋白胨 2,KH2PO42,MgSO40.1,初始 pH值 5.5,裝液量 50 mL/250 mL三角瓶,115℃滅菌 20 min。

1.3.3 產氫培養基

乙醇發酵殘液 600 mL/L,營養液 10 mL/L,初始pH7.0,裝液量為 32 mL/140 mL血清瓶。營養液組成如下:80 g/L NH4HCO3;12.4 g/L KH2PO4;0.1 g/L MgSO4·7H2O;0.01 g/L NaCl;0.01 g/L Na2MoO4·2H2O;0.01 g/L CaCl2·2H2O;0.015 g/L MnSO4·7H2O;0.027 8 g/L FeCl2。

1.4 菌種培養方法

1.4.1 產乙醇發酵培養

將冰箱中保藏的嗜鞣管囊酵母Pachysolen tannophilusG21斜面菌種接種到活化斜面上,30℃靜置培養 48 h;將活化后斜面菌種接入種子培養基,30℃、150 r/min振蕩培養 24 h。取種子培養液以 8%的接種量接入乙醇發酵培養基,30℃,150 r/min振蕩培養。間隔一定時間取樣檢測殘糖和乙醇濃度。每個樣品做 3個平行樣。

1.4.2 產氫發酵培養

為富集產氫微生物,提高天然產氫菌的產氫活性,將牛糞堆肥用適量水浸泡,煮沸 15 min后,過濾取上清液。在上清液中加入 5 g/L蔗糖和 5 mL/L營養液,36℃厭氧預培養 16 h作為產氫種子液;將 30 mL乙醇發酵液煮沸 15 min,除去乙醇,加入 2 mL營養液和 18 mL預培養產氫種子液,裝入 140 mL批式反應器中,用稀酸或稀堿溶液調節至初始 pH值 7.0,用N2吹掃剩余空間的 O2,用醫用橡膠塞密封,(36±1℃)恒溫振蕩。定時檢測產氣量,分析氣相產物中H2、CO2和甲烷的濃度。

1.5 秸稈稀酸水解方法

將粉碎至 40目的風干玉米秸稈,用 2%H2SO4浸泡,固液比 1∶10,121℃酸水解 1 h,自然冷卻后過濾,水解液體與固體殘渣于 4℃下分別保存待用。

1.6 分析方法

1.6.1 糖含量測定

采用 3,5二硝基水楊酸 (DNS)法測定還原糖含量,采用苔黑酚法測定木糖含量,采用氣相色譜法測定葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖等單糖含量[9]。

1.6.2 氣相和液相組分分析

生物氣中氫氣、甲烷和二氧化碳含量用氣相色譜法測定[10]。發酵液經離心過濾后,取 2 mL上清液,用 0.45μm微孔濾膜過濾,濾液中乙醇、乙酸和糠醛的含量用氣相色譜法測定[9,11]。

1.6.3 玉米秸稈中各成份的測定

利用 Van Soest法[12]測定玉米秸稈中的纖維素、半纖維素、木質素的含量。

1.6.4 累積產氫量的測定

按一定時間間隔用排飽和食鹽水法排出發酵瓶內氣體,測量氣體體積。累積產氫量公式:

其中:V為累積產氫量 (mL);V0為反應器液面上空的體積 (mL);Vi為第i次抽出氣體的體積(mL);i為第i次抽出氣體中氫氣含量。

單位累積產氫量的計算公式:

其中:H為單位累積產氫量 (mL H2/g TS);V為累積產氫量 (mL);m為反應底物的質量 (gTS)。

2 結果與討論

2.1 玉米秸稈稀酸水解液成分分析

對稀酸處理后的玉米秸稈水解液進行還原糖含量測定和成分分析,結果如表1所示。研究表明,稀酸處理后的玉米秸稈水解液中含有木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等單糖組分,其中木糖含量最高,達到 24.3 g/L,占水解液總還原糖含量的 79%,阿拉伯糖含量次之,約占水解液還原糖含量的 12%,葡萄糖和甘露糖含量最低,分別占水解液還原糖含量的 5%和 4%。這說明玉米秸稈半纖維素的結構單元主要為木糖和阿拉伯糖。但是,除單糖組分外,玉米秸稈酸水解液中還含有較高濃度的乙酸和糠醛,含量分別為 2.08 g/L和 0.95 g/L,它們對酵母細胞有較強的毒害作用。另外,在稀酸水解過程中,水解液色澤會加深,這是因為玉米秸稈中含有天然色素顯色,同時原料中的含氮物質 (如氨基酸和多肽),在加熱過程中也會產生有色物質,使水解液色澤加深。

表1 玉米秸稈酸水解液成分分析

2.2 玉米秸稈稀酸水解液的脫毒處理

玉米秸稈酸水解液成分比較復雜,除了表1中列出的成分外,還含有 H2SO4(約 20.0 g/L)以及色素和酚類等有害物質,必須進行脫毒處理,以提高水解液的發酵性能。本文系統研究了過量堿法、旋轉蒸發和離子交換樹脂吸附等方法對酸水解液中抑制物的脫毒效果。在各種脫毒的水解液加入乙醇基本發酵培養基配方中除去秸稈的其他成份,滅菌后接種嗜鞣管囊酵母 G21進行乙醇發酵。

過堿處理是廣泛采用的酸水解液脫毒方法[13]。常用的堿是石灰,因為石灰可以和 H2SO4反應生成CaSO4,CaSO4在沉淀的同時可吸附水解液中部分抑制物,如乙酸、糠醛、色素等。CaSO4在水中以不同的結晶水形式存在,在 70～80℃下溶解度最小,故在70℃的酸水解液中加入石灰乳,中和玉米秸稈酸水解液至不同 pH值,研究其對水解液脫毒和乙醇發酵的影響。由表2可以看出,當水解液中和至 pH值 5.0時,水解液中的 SO42-已基本除去,但是乙酸和糠醛去除量很少。當水解液過中和至 pH值 10.0時,隨著生成的 CaSO4不斷增多,吸附乙酸和糠醛的量也隨之增加,糠醛和乙酸濃度分別由脫毒前的 0.95 g/L和 2.08 g/L降至 0.11 g/L和 1.78 g/L,去除率分別為 88.4%和 14.4%,但同時水解液中還原糖的損失率達到 6.5%。如果逐漸增加中和的 pH,雖然乙酸和糠醛的去除率有所提高,但是還原糖的損失也進一步加大。過堿處理對水解液中糠醛的去除效果要遠大于對乙酸的去除效果。水解液過中和至 pH值10.0與未脫毒以及其他中和條件相比,經嗜鞣管囊酵母 G21發酵后,能得到更高的乙醇產量和乙醇得率,發酵液中殘糖大幅度降低。過堿處理能如此有效除去抑制物的原因在于其對有毒物質的沉淀作用和一些抑制物質在高 pH值時的不穩定。據報道,Nilvebrant使用 Ca(OH)2調稀酸處理的云杉水解液至pH值 10,使水解液中糠醛和羥甲基糠醛量減少20%[14],但同時乙酸濃度變化不大,這與我們的研究結果是基本一致的。

真空旋轉蒸發是利用水蒸汽將玉米秸稈酸水解液中較易揮發的乙酸和糠醛等抑制物進行脫除。利用旋轉蒸發器將酸水解液體積濃縮至原體積的 1/4,然后補加蒸餾水至原體積。由表2可知,真空旋轉蒸發對水解液中的乙酸和糠醛有較好的去除效果,而且不會造成對水解液中糖類物質的損失,但缺點是不能去除水解液中的 SO42-。玉米秸稈酸水解液經石灰過中和,水解液中仍然殘留較易揮發的乙酸等發酵抑制物。將石灰中和至 pH值 10.0的酸水解液進行真空旋轉蒸發,由表2可以看出,真空旋轉蒸發降低了水解液中乙酸、糠醛等物質濃度。蒸發 30 min后,乙酸去除率為 55.8%,糠醛被全部除去。經發酵后,與未經脫毒處理的水解液相比,乙醇得率由 68.0%提高至 86.2%,顯著提高了水解液的乙醇發酵性能。采用過堿處理和真空旋轉蒸發揮發對水解液進行脫毒,具有較好的實際應用價值。

表2 脫毒處理對玉米秸稈酸解液成分和乙醇發酵產率的影響

為了考察離子交換樹脂對水解液中抑制物的脫毒效果,將未經中和的玉米秸稈稀酸水解液用弱堿性樹脂 D301進行吸附處理。由表2可知,酸解液經過弱堿性樹脂 D301處理后脫毒效果明顯,且水解液中和乙酸根離子均與樹脂發生交換吸附,其中乙酸去除率為 74.0%,糠醛去除率為 66.3%,且還原糖損失量較小。若將離子交換樹脂吸附和真空旋轉蒸發結合,酸水解液中糠醛和乙酸的去除率分別達到100%和 89%,還原糖損失較少,乙醇得率達到85.2%。

上述結果表明:若采用單一的脫毒處理方式,秸稈酸解液不能達到預期的脫毒效果,當采用樹脂吸附結合真空旋轉蒸發的聯合處理方式脫毒效果更佳。

2.3 酸解玉米秸稈兩步發酵聯產乙醇-氫氣

玉米秸稈經酸解和脫毒處理后,過濾,水解液用于乙醇發酵。乙醇發酵廢液蒸餾出乙醇后,與秸稈水解固體殘渣、天然產氫菌按比例混合用于產氫發酵,結果見表3。試驗結果表明,乙醇產量和乙醇得率與秸稈水解液的脫毒方式和脫毒效果密切相關。當脫除糠醛和乙酸徹底時,乙醇產量和乙醇得率較高。當采用樹脂吸附結合真空旋轉蒸發的處理方式時乙醇產量達到最大值 11.8 g/L(以每克秸稈的 TS為基準換算,則相當于 131.1 mg/g TS),且發酵液中殘糖最低。當秸稈酸解液未經脫毒處理時,僅得到最低的氫氣產量 3 827 mL/L,這可歸因為水解液中有毒物質對產氫菌的抑制作用所致。在其他脫毒處理方式下,相應的氫氣產量變化不大,在 4 000～4 200 mL/L(42.5～46.7 mL/g TS)范圍內波動。在本研究中,玉米秸稈轉化乙醇和氫氣的效率最高達到 131.1 mg乙醇 /g TS和 44.6 mL H2/g TS。

表3 脫毒處理對玉米秸稈乙醇-氫氣發酵產量的影響

2.4 玉米秸稈兩步發酵聯產乙醇-氫氣的能量分析

以乙醇、氫氣和秸稈的燃燒值為基準可計算玉米秸稈乙醇-氫氣聯產系統的能量回收率。根據秸稈中可溶性糖、纖維素和半纖維素轉化為同量葡萄糖的燃燒值,計算出秸稈的燃燒值為 13.45 kJ/g-干秸稈。乙醇和氫氣的燃燒值分別為 1367.8 kJ/mol和 285.8 kJ/mol。按照如下公式進行能量分析:

其中,A為乙醇產量 mol/g干秸稈;B為氫氣產量 mol/g干秸稈。

在上述研究中,稀酸水解的玉米秸稈最大乙醇產量和氫氣產量分別為 131.1 mg乙醇/g TS和 44.6 mL H2/g TS,由此可計算出秸稈 2步發酵聯產乙醇和氫氣的能量回收率為 33.2%,較大限度地利用了纖維質原料,這對生物能源的規模化生產具有一定的指導意義。

2.5 玉米秸稈降解機理

為了探討玉米秸稈降解產乙醇產氫的機理,本文分析了稀酸處理前后和發酵產氫前后玉米秸稈中纖維素和半纖維素含量的變化 (以初始秸稈 TS為基準計算)。由圖1可知,稀酸處理前后玉米秸稈中半纖維素含量變化量最大,由 309.0 mg/g TS降至 37.3 mg/g TS,而纖維素含量由 391.0 mg/g TS降至 356.0 mg/g TS,這說明經過稀酸處理后溶液中可溶性糖的增加主要是因為半纖維素的水解,部分是因為纖維素的水解。生成的可溶性糖可被酵母發酵生成乙醇。乙醇發酵醪液中殘糖量約為 2.0～6.2 g/L(見表2),這些殘糖若按照丁酸型發酵理論產氫量約為 500～1 500 mL/L,按照乙醇型發酵產氫量應為 1 000～3 000 mL/L。而由表3可知,本研究中得到的產氫量為3 827～4 201 mL/L,遠遠大于殘糖的理論產氫量。另外,產氫前后玉米秸稈殘渣中纖維素含量由 356.0 mg/g TS降至 194.1 mg/g TS。由上述分析可知:牛糞堆肥中的天然產氫微生物具有直接降解纖維素發酵產氫的能力,氫氣的生成主要來自于纖維素的直接降解發酵產氫和乙醇發酵醪液中殘糖的發酵產氫。

圖1 不同條件處理后玉米秸稈成分分析

3 結論

(1)本研究首次構建了玉米秸稈 2步發酵聯產乙醇-氫氣體系。以稀酸水解玉米秸稈時,采用離子交換樹脂吸附結合真空旋轉蒸發對玉米秸稈稀酸水解液進行脫毒處理效果最好,乙醇和氫氣的最大產量分別為 131.1 mg/g TS和 44.6 mL/g TS,其秸稈的能量回收率為 33.2%。

(2)玉米秸稈經稀酸處理后絕大多數半纖維素被降解,嗜鞣管囊酵母 G21可利用其生成的可溶性糖發酵產乙醇。天然產氫微生物具有直接降解纖維素發酵產氫的能力。

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