汾酒大曲和酒醅樣品DNA提取方法的優化＊

閆亮珍,李曉然,全哲學,馬恩波

汾酒歷史悠久、風味獨特,是清香型白酒的典型代表,產于山西省杏花村,有著幾千年的傳統工藝釀造歷史。汾酒釀造工藝流程中所含有的微生物種群是構成其獨特風味的主要因素之一[1]。

PCR技術現已成為功能基因組學研究廣泛應用的技術[2]。在 PCR擴增過程中,模板 DNA的提取質量及純度往往是決定 PCR能否擴增出目標條帶的限制因素[3]。DNA提取是分子生物學研究中的關鍵技術,其結構的完整性和純度直接決定后續實驗能否順利進行[4]。提取汾酒酒曲及酒醅微生物總 DNA,對其中細菌特異 DNA序列 16S rDNA基因及真菌的ITS序列進行特異性擴增,通過擴增分析 PCR產物,可鑒定汾酒酒曲和酒醅樣品的微生物種類及主要優勢菌。

目前用于微生物 DNA的提取有很多種方法,如Martin法、高鹽改進法及試劑盒法等[5],雖然試劑盒法操作簡單,能獲得較高質量的 DNA,但據文獻報道,此種方法 DNA得率較低且成本昂貴,因此選擇一種可靠的適合汾酒樣品的DNA提取方法顯得尤為重要。常用的DNA提取方法主要有以下 3種:(1)物理方法,即通過外力作用破壞細胞結構,主要有液氮凍融法、玻璃珠振蕩法、液氮研磨法、超聲振蕩法和微波熱休克法等。理論上,物理方法是最有可能得到微生物群落完整 DNA的方法,但由于物理方法較為劇烈,得到的 DNA片段往往較小。(2)化學法,最常用的化學裂解試劑為十二烷基硫酸鈉 (SDS),它可以溶解細胞膜上的疏水材料,其它試劑如洗滌劑等通常在熱處理時與螯合劑 (如 EDTA)共同使用。(3)酶法,常用的為溶菌酶,主要用于細菌 DNA的提取,加入其它酶如溶壁酶可用于提取真菌 DNA,蛋白酶 K用于處理DNA中的蛋白質污染等[6]。本文綜合分析了上述各種方法的優越性,采用酶物理化學法的 DNA提取方法,不僅獲得了汾酒樣品中高質量的微生物DNA,而且成本較試劑盒提取法為低。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

樣品:汾酒酒曲、汾酒酒醅和環境樣品均取自山西杏花村汾酒股份有限公司。

主要實驗試劑:Lysozyme(溶菌酶 )、15μL 15 mg/mL Lyticase(溶壁酶 )、蛋白酶 K、DH5α感受態大腸桿菌,均購于 TI ANGEN公司;pMD18-T,購于 TaKa-Ra公司;玻璃珠,購于 Sigma公司。

Lysing buffer(配制):0.1 mol/L Tris-HCl,0.1 mol/L EDTA(pH值 8.0),0.75 mol/L蔗糖。

Extraction Buffer(配制):0.1 mol/L磷酸鹽,0.1 mol/L EDTA(pH值8.0),0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.0),1.5 mol/L NaCl,1%CTAB。

1.2 樣品總 DNA提取方法

1.2.1 酶法 +液氮凍融法 +化學法 (即酶物理化學法[7])

1.2.1.1 樣品預處理

(1)酒醅樣品預處理

酒醅處理方法 1:取約 250μL(約 0.25 g)樣品置于 2 mL離心管中,加 1 mL無菌水,振蕩器振蕩 1 min,10 000 r/min離心 5 min,去掉液體,重復 3次。

酒醅處理方法 2:取約 250μL(約 0.25 g)酒醅置于 2 mL離心管中,加入 1 mL無菌水,振蕩器振蕩 1 min,振蕩完后直接取振蕩渾濁液 (不含酒醅中的顆粒物質)于一新的離心管中,10 000 r/min離心 5 min,去掉上清液,重復 3次。

(2)酒曲樣品預處理

酒曲曲塊質地比較堅硬,在取樣之前需先將曲樣粉碎成均勻的粉末。用已滅菌處理過的藥勺取約250μL(約 0.1 g)已粉碎好的樣品置于 2 mL離心管中,加 1 mL無菌水,于振蕩器振蕩 1 min,10 000 r/min離心 5 min,去掉液體,重復 1～2次。

(3)環境樣品預處理

環境樣品的采樣方法是將環境微生物吸附于濾紙或棉球上。在樣品處理步驟中用已滅菌的剪刀和鑷子將濾紙和棉球剪碎,加入 1 mL無菌水,振蕩器振蕩 1 min,10 000 r/min離心 5 min,去掉上清液。

1.2.1.2 DNA的提取

(1)加 450μL Lysing buffer,10μL 50 mg/mL Lysozyme(溶菌酶 )和 15μL 15 mg/mL Lyticase(溶壁酶),37℃水浴 30 min。(2)加入 25μL 20%SDS和5μL 20 mg/mL蛋白酶 K。(3)55℃水浴 2 h,加 0.1 g(約 100μL)玻璃珠,劇烈振蕩 5 min。(4)液氮凍融3次。 (5)加入 80μL 5 mol/L NaCl和 60μL 10%CTAB/NaCl,混勻,65℃水浴 20 min。(6)加入等體積的酚 /氯仿 /異戊醇 (25∶24∶1),混勻。 (7)12 000 r/min離心 10 min,把上清液轉移到新的 1.5 mL離心管中,若上層水相很混濁或顏色深,需重復步驟 7～8。(8)加等體積的三氯甲烷 /異戊醇 (24∶1),混勻。(9)12 000 r/min離心 10 min,把上清液轉移到新的1.5 mL離心管中,若上層水相很混濁或顏色深,需重復步驟 9～10。(10)加 0.6倍體積的異丙醇,-20℃過夜。(11)12 000 r/min離心 15 min,盡量倒掉液體。(12)用 500μL預冷 70%乙醇洗滌,12 000 r/min離心 15 min。(13)棄上清液,65℃烘干 30 min,至烘干為止,最后加 50μL TE溶解,保存。

1.2.2 液氮研磨法 +化學法 (即物理化學法[8])

(1)稱取 2 g樣品和 1 g玻璃珠置于已滅菌的研缽中。(2)加液氮覆蓋樣品并于解凍前用力研磨,重復本步驟 3～4次,把樣品轉移至 50 mL離心管。(3)加 9 mL Extraction Buffer,小心混勻。(4)60℃水浴 3 min。 (5)加 1 mL 20%SDS,小心混勻。(6)60℃水浴 15 min,每 5 min搖勻 1次。(7)4 400 r/min離心 10 min。(8)將上清轉移至新的 50 mL離心管中,沉淀重復步驟 3～7。(9)合并上清液,4400 r/min離心 10 min。(10)將 CTAB覆蓋下的液體轉移到一個新的 50 mL離心管中,加等體積的氯仿 /異戊醇 (24∶1),4 400 r/min離心 20 min。(11)收集上清水相,加 0.6體積的異丙醇小心混勻,室溫沉淀 30 min。(12)16 000 r/min離心 20 min。(13)小心倒掉液體,65℃烘干 30 min,至烘干為止。(14)加 120μL TE溶解。

1.3 細菌 16S rDNA及真菌 ITS DNA片段的 PCR擴增

采用對細菌 16S rDNA具有特異性的通用引物(Muyzer et al.,1993)。正向引物 27f:5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’,反向引物 1512r:5’-ACG GHTACC TTG TTA CGA CTT-3’。真菌 ITS區特異性正向引物 NAS3:5’-AAA CTC TGT CGT GCT GGG GATA-3’,反向引物 NLC2:5’-GAG CTG CAT TCC CAA ACA ACT C-3’。引物由北京 Invitrogen公司合成,Master Mix購于天根生化科技 (北京)有限公司。在 0.2 mL的離心管中配制 PCR反應體系 (表1)。PCR反應條件為 95℃預變性 5 min,94℃變性 5 min,56℃退火 1 min,72℃延伸 1 min 30 s,反應 30個循環,最后 72℃延伸 15 min,4℃結束。

表1 PCR反應體系

1.4 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測

1.5 克隆文庫構建及測序分析

膠回收產物連入載體 pMD18-T并轉入 DH5α感受態大腸桿菌中,轉化培養建立克隆文庫,對每個克隆文庫隨機挑取克隆進行測序。

1.6 克隆文庫的微生物多樣性分析

使用 DOTUR軟件對相似度大于 97%(即 cut off值 ＜0.03)的基因序列進行操作分類單元 (OTU)歸類。采用 Chao豐富度指數,ACE豐富度指數以及rarefaction指數值進行微生物物種的多樣性分析。

1.7 實驗結論的驗證

為了驗證酶物理化學法是否對其它樣品DNA也有很好的提取效果,我們選擇了其它的酒醅和酒曲樣品進行DNA提取和 PCR擴增。

2 結果與分析

2.1 酒醅樣品兩種不同預處理方法結果

在酒醅 2種不同預處理方法比較中,DNA提取方法采用的是酶化學物理法。圖1中 1、2、6、7為酒醅處理方法 2得到的結果,3、4、8、9為酒醅處理方法1得到的結果,5、10是空白對照,從圖中可以看出處理方法 1較處理方法 2有更好的DNA得率。

圖1 酒醅樣品不同預處理方法 PCR產物的電泳檢測結果

2.2 酶物理化學法與物理化學法比較

本文將物理化學法和酶化學物理法 2種不同的DNA提取方法進行了比較,樣品預處理采用較好的樣品處理方法 1(見圖1),對得到的細菌和真菌的克隆文庫進行了群落組成分析 (見表2和表3)。結果表明,通過酶物理化學法可以得到更多的汾酒微生物分類信息,同時由于酶在適宜條件下高效專一的特點,使得酶物理化學法操作起來簡便、省力。

表2 兩種 DNA提取方法得到的細菌克隆文庫比較

2.3 兩種不同 DNA提取方法得到的微生物多樣性比較分析

多樣性計算結果見表4。從表4可以看出,酶物理化學法得到的真菌和細菌的 Chao豐富度指數明顯高于物理化學法得到的種類,同樣,酶物理化學法得到的微生物 ACE豐富度指數也明顯高于物理化學法,rarefaction值的差異雖然沒有 Chao和 ACE明顯,但同樣也說明了酶物理化學法的優越性。由此可見酶物理化學法提取DNA更能體現酒曲樣品中微生物種類的多樣性。

表3 兩種 DNA提取方法得到的真菌克隆文庫比較

表4 不同DNA提取方法得到的微生物多樣性比較分析

2.4 酶物理化學法提取的總 DNA及 PCR產物檢測結果

圖2 汾酒樣品總DNA的檢測結果

為了進一步驗證酶物理化學法 (酒醅樣品預處理采用方法 1,酒曲樣品預處理見 b)的可行性,我們對其它酒醅和酒曲樣品進行了DNA提取。從圖2中可以看出采用酶物理化學法,獲得了清晰可見的基因組 DNA條帶,這為 16S r DNA和 ITS特異片段的 PCR擴增、特異片段克隆培養及測序提供了重要條件。圖3為 PCR產物的電泳結果,得到了清晰的擴增條帶,也證實了DNA的成功提取。

圖3 酒醅不同時期 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

3 討論

常規的微生物DNA提取多根據不同微生物的特點或具體實驗要求選擇合適的提取方法。汾酒酒醅和酒曲樣品及環境樣品中微生物含量豐富,種類繁多,從中提取的 DNA可用于分析在常規培養條件下難以培養出的微生物,跟蹤其中某些主要菌株的微生物生長情況,亦可用來分析酒曲樣品中微生物種類的多樣性及其隨時間和環境條件的變化情況[9]。因此,從汾酒不同樣品中提取高質量的 DNA就成為最關鍵的技術之一。張寧等對各種DNA提取方法進行研究總結[9],雖然不同生物的 DNA提取方法不盡相同,但各種方法亦可相互借鑒。

汾酒酒醅中含有發酵過程所產生的酒精等微生物次級代謝產物,而微生物次級代謝產物無疑對后續DNA提取時所加入的酶,如溶菌酶 (Lysosome)、溶壁酶 (Lyticase)、蛋白酶 K(Proteinase K)等活性產生抑制,所以在進行酒醅 DNA的提取時,我們通過加入無菌蒸餾水反復洗滌離心的方法達到去除殘留酒精的目的;對于酒曲樣品 DNA的提取,無菌蒸餾水反復洗滌離心這一步驟也很重要,原因是不同時期酒曲樣品中水分含量很少,曲塊硬,導致其吸水性強,如果不進行蒸餾水的反復洗滌,直接加入 lysing buffer以及溶菌酶及溶壁酶,酒曲樣品會將 lysing buffer全部吸收,從而使得溶菌酶及溶壁酶起不到酶解的作用;環境樣品的取樣具有一定的特殊性,一般是通過濾紙和棉球吸附的方式取樣,DNA提取前的樣品處理尤為重要,處理的方法是在加入無菌蒸餾水的情況下,將吸附有微生物的濾紙和棉球用剪刀剪盡量剪碎。這樣在離心后濾紙和棉球能夠沉淀于離心管底部,而不是貼在離心管壁上,保證 DNA的順利提取。對于不同汾酒樣品 DNA的提取,樣品前處理是一個相對耗時的過程,但此步驟很關鍵,一旦樣品處理好,之后就可以進行快速、大量的 DNA提取。另外,細胞破碎對真菌DNA的提取也是很重要的步驟。本文采用酶裂解法以及液氮凍融法處理真菌細胞壁,即物理破壁法,保證了真菌DNA的順利提取。

酒醅樣品的不同處理方法結果表明,汾酒酒醅樣品微生物大多富集在酒醅中的谷物上,方法 2通過渦旋振蕩可以將其洗滌下來,但由于洗滌不完全,導致實驗不能將酒醅樣品中的微生物DNA盡量完整地提取出來,這無疑為酒醅樣品中微生物群落多樣性的分析帶來影響。而方法 1不需要細胞提取,且提取的DNA更能代表樣品的微生物群落,它的缺點是提取DNA的同時也提取了樣品中的其他成分,有些成分會干擾后續實驗[10]。方法 2是在裂解釋放 DNA之前,先將微生物細胞從它們的環境基質中分離出來,這一方法的局限主要是很多細菌會吸附在樣品顆粒上不能被分離出來,結果將會導致所反映的樣品中微生物群落具有片面性,本文結果也說明了這一點 (見圖1)。綜上所述,方法 1與方法 2各具優缺點,實際操作中要根據實驗的具體情況選擇合適的方法,本實驗中由于汾酒酒醅本身所具有的特殊性,即不同發酵階段的酒醅樣品對微生物的吸附程度有所不同,所以采用了酒醅處理方法 1,該方法操作簡單易行,同時也消除了方法 2中洗滌不完全因素的影響,保證了酒醅樣品中微生物 DNA的完全提取。因此,方法 1較方法 2為好。

酒醅樣品不同 DNA提取方法結果表明,利用酶物理化學方法可從汾酒樣品中將真菌及細菌的基因組 DNA完整地提取出來,后續克隆測序結果表明,通過酶化學物理法提取獲得的高質量DNA能全面反映汾酒制備過程中微生物群落結構的多樣性。

綜上所述,對于酒醅樣品預處理來說,方法 1較好;對于樣品不同的 DNA提取方法,酶物理化學法較好,因此采用酶物理化學法結合酒醅樣品處理方法 1進行DNA的提取。

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