南美白對蝦蝦頭主要自溶酶的分離純化及鑒定

銀鳳,周愛梅,張祥剛,曹庸,劉欣,陳永泉

南美白對蝦又稱凡納對蝦,是世界上養殖產量最高的三大優質蝦種之一,也是目前世界上三大養殖對蝦單產量最高的蝦種。南美白對蝦殼薄體肥,肉質鮮美,含肉率高,是一種高蛋白、高鈣、低脂肪的食物。

南美白對蝦在儲藏過程中,常常發生發臭等腐敗現象,除了微生物的作用外,蝦頭中的內源酶在蝦的自溶過程中起到重要作用。據報道,南美白對蝦蝦頭中內源酶種類復雜,含量豐富,且活性很高[1-2]。這些內源酶在蝦存活時起消化作用,死亡后又起到了降解蛋白質的作用,目前對于南美白對蝦蝦頭中的內源酶的研究報道較少[3-4],哪類酶或哪種酶在蝦的腐敗、蛋白質分解中起主要作用的研究尚未見報道。為此,本實驗以內源酶水解實驗為檢測指標,通過硫酸銨分級沉淀、Sephadex G-100凝膠層析、DEAE-DE52陰離子交換層析等方法分離純化南美白對蝦蝦頭中的主要自溶酶,并通過抑制劑試驗及 SDS-PAGE對純化酶進行鑒定,從而合理解釋蝦的自溶現象,為南美白對蝦的貯藏控制及蝦的自溶水解提供科學指導和理論依據,同時也為蝦頭廢棄物的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及儀器

南美白對蝦蝦頭、蝦殼,由陽江市誼林海達速凍水產有限公司提供,-18℃冷凍備用。

胰蛋白酶標準品、苯甲基磺酰氟 (PMSF)、胃酶抑素 A(Pepstatin A),Sigma公司;碘乙酸,上海伯奧生物科技有限公司;乙二胺四乙酸 (EDTA),天津市科密歐化學試劑發展中心;Sephadex G-100,瑞典Pharmacia公司;DEAE-DE52,英國 Whatman公司;其余試劑均為市售生化或分析純試劑。

752型紫外可見分光光度計,上海精密科學儀器有限公司;層析柱 (1.6×40 cm),上海嘉鵬科技有限公司;TH-1000A梯度混合器、HD-21-Z紫外檢測儀,上海青浦滬西儀器廠;JM-250電泳儀,大連捷邁科貿有限公司;DYZ-28A型電泳槽,北京六一儀器廠;B I O-BEST140M凝膠成像系統,西盟國際公司中國(總部 )。

1.2 試驗方法

1.2.1 南美白對蝦蝦頭粗酶液的制備

以自來水解凍蝦頭,然后加入一定量的 pH 7.0磷酸鹽緩沖液,經組織搗碎機搗碎,加入 pH 7.0磷酸鹽緩沖液得到料液比 1∶3(g∶mL)的組織液,在 20℃抽提蝦頭 6 h,10 000 r/min離心 20 min,取上清液即為粗酶液。

1.2.2 硫酸銨分級沉淀

按飽和度 25%、35%、45%、55%、65%、75%在4℃逐步進行硫酸銨分級沉淀,鹽析過夜,然后 12 000 r/min冷凍離心 20 min。將所得沉淀用一定體積的預冷超純水溶解,測定蛋白質含量和酶活力。

1.2.3 Sephadex G-100凝膠層析

將經硫酸銨沉淀、透析除鹽、真空冷凍干燥濃縮后的樣品用一定體積超純水溶解,12 000 r/min冷凍離心 20 min,取上清液上樣 (1.6×40 cm,其中平衡緩沖液為 pH值 7.0、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液),以 pH值 7.0的低離子濃度 (0.01 mol/L)磷酸鹽緩沖液和pH值 7.0的高離子濃度磷酸鹽緩沖液 (0.1 mol/L,含 0.2 mol/L NaCl)各 100 mL為洗脫液進行梯度洗脫,流速為 30 mL/h,每 6 min收集 1管,分別測定每管收集液的蛋白質含量與酶活力。

1.2.4 DEAE-DE52陰離子交換柱層析

將上述凝膠層析收集的樣品冷凍干燥濃縮,用一定量超純水溶解,12 000 r/min冷凍離心 20 min,取上清液上樣 (1.6×40 cm,其中平衡緩沖液為 pH值7.0、0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液 ),以 pH值 7.0低離子濃度 (0.01 mol/L)Tris-HCl緩沖液和 pH值 7.0的高離子濃度 Tris-HCl緩沖液 (0.1 mol/L,含 0.2 mol/L NaCl)各 100 mL為洗脫液進行梯度洗脫,流速為30 mL/h,每 6 min收集 1管,分別測定每管收集液蛋白質含量和酶活力。

1.2.5 內源酶對蝦頭、蝦殼的水解試驗

在 pH值 7.0、溫度 55℃、料水比 1∶2(g∶mL) 的條件下,通過添加一定量的蝦頭提取物 (含內源酶)對已高溫滅酶的蝦頭、蝦殼進行水解,5 h后采用甲醛滴定法[5]測定氨基酸態氮含量。

1.2.6 抑制劑實驗

參考 Klomklao等[6]的方法并略作修改。在酶溶液中加入等體積的蛋白酶抑制劑,使抑制劑在酶溶液中的終濃度分別為:1 mmol/L PMSF、2μmmol/L Pepstatin A、1 mmol/L碘乙酸、2 mmol/L EDTA,室溫下靜置 1 h后,分別取 1 mL反應液測定酶活力,同時以加入同體積的去離子水代替抑制劑的酶溶液在相同條件下測得的酶活力定義為 100%,計算不同抑制劑的抑制率。

1.2.7 SDS-PAGE

參考 Laemmli[7]的方法進行 SDS-PAGE,分離膠濃度為 12.5%,濃縮膠濃度為 4.5%。10μL酶樣品或標準蛋白與 10μL上樣緩沖液充分混合后,水浴100℃處理 3 min,冷卻后上樣。起始電流為 15 mA,待溴酚藍前沿進入分離膠后將電流調為 30 mA,當溴酚藍前沿跑至距膠底部 0.5 cm時終止電泳,取下凝膠用考馬斯亮藍染色法進行染色。

1.2.8 蛋白質含量、內源酶酶活力測定

蛋白質含量測定參見考馬斯亮藍法[8];內源酶酶活力采用紫外檢測法[9],以酪蛋白為底物。

2 結果與分析

2.1 硫酸銨分級沉淀

采用不同飽和度的硫酸銨對粗酶液中的南美白對蝦蝦頭主要自溶酶進行純化,測定沉淀中的蛋白質含量及蛋白酶活力,結果如圖1所示。當硫酸銨濃度為 20%～30%時,沉淀中的蛋白酶活力與初始值基本保持不變,且酶活力較低,表明這一階段沉淀的蛋白為雜蛋白;隨硫酸銨濃度由 30%增加到 70%,沉淀中的蛋白質含量與蛋白酶活力不斷增加,其中酶活力較硫酸銨飽和度為 30%時提高 7倍多,說明此階段沉淀的蛋白主要為目的蛋白;當飽和度大于 70%后,蛋白質含量雖然增加,酶活力卻略有下降,表明大部分的蛋白酶已被沉淀下來。因此,為了較好地達到去除雜蛋白的目的,實驗選取的硫酸銨飽和度為 30%～70%。

圖1 硫酸銨飽和度對南美白對蝦蝦頭蛋白質含量及蛋白酶活力的影響

2.2 Sephadex G-100凝膠層析

鹽析處理后的酶液經透析除鹽、冷凍干燥后,進行 Sephadex G-100凝膠層析,以管號為橫坐標,以蛋白質含量及酶活力為縱坐標繪制洗脫曲線,結果如圖2所示。蛋白質洗脫曲線主要分為 2個峰,其中第 1個峰出現在第 5～9管,此時蛋白質含量很高;第 2個峰出現在第 22～32管之間,該峰出峰時間間隔較長,含量較第 1個物質略低;而主要酶活力峰出現在這 2個蛋白峰之間,根據酶活力曲線與蛋白質含量曲線,把收集到的成分分成 6個部分,分別為 1～4、5～6、7～9、10～19、20～28、29～40六個組分。

圖2 Sephadex G-100凝膠層析洗脫曲線

對 6個組分進行冷凍干燥濃縮,并以相同質量蛋白加入到已滅酶的蝦頭蝦殼中,進行水解試驗,結果如圖3所示。水解實驗表明,組分Ⅳ的氨基酸態氮含量最高,水解作用最明顯,說明起水解作用的主要內源酶集中在該組分,收集該組分進一步分離純化同時取樣進行 SDS-PAGE。

圖3 Sephadex G-100凝膠層析收集組分水解試驗

2.3 DEAE-DE52陰離子交換柱層析

為了制得純度更高的自溶酶,對組分Ⅳ進行 DEAE-DE52陰離子交換柱層析 (圖4)。洗脫曲線主要分為 2個組分峰,其中組分峰Ⅰ洗脫液具有較高蛋白質含量,但酶活力卻較低;組分峰Ⅱ酶活力為第一組分峰的 4倍左右,收集 2個組分峰的成分,冷凍干燥濃縮后進行水解實驗,結果見圖5。圖5結果顯示,組分Ⅱ的水解液中氨基酸態氮含量較高,水解作用最明顯。因此,收集該組分進行抑制劑實驗及 SDS-PAGE。

圖4 DEAE-DE52陰離子交換柱層析洗脫曲線

圖5 DEAE-DE52陰離子交換柱層析收集組分水解試驗

2.4 主要自溶酶的分離純化結果

分別對每步收集的酶液測定酶活力與蛋白質含量,計算比活力與純化倍數,結果見表1。純化處理后的蛋白酶比活力高達 2.2×106U/g,純化倍數為96.90。

表1 各處理蛋白酶比活力及純化倍數對比

2.5 主要自溶酶的鑒定

2.5.1 純化后主要自溶酶的抑制劑試驗

對DEAE-DE52陰離子交換柱層析后收集的組進行抑制劑實驗,結果如圖6所示。所選用抑制劑中,P MSF是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑[10],Pepstatin A是天冬氨酸蛋白酶特異性抑制劑[6],EDTA為金屬蛋白酶特異性抑制劑[11],碘乙酸是半胱氨酸蛋白酶的特異性抑制劑[6]。結果顯示,絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對該組分抑制效果最為明顯,抑制率高達91.3%,而其它抑制劑對其抑制效果不明顯,說明該組分純度較高且以絲氨酸蛋白酶為主要酶類。

圖6 純化后組分Ⅱ的抑制劑試驗

2.5.2 SDS-PAGE

對DEAE-DE52陰離子交換柱層析后組分Ⅱ進行 SDS-PAGE,結果如圖7所示。經 DEAE-DE52陰離子交換柱層析后組分Ⅱ的 SDS-PAGE顯示,電泳圖只顯示出一條泳帶,且該帶與標準胰蛋白酶在電泳中移動距離相同,表明南美白對蝦蝦頭主要自溶酶為胰蛋白酶。

3 結論

南美白對蝦蝦頭粗酶液經 30%～70%飽和硫酸銨分級沉淀、Sephadex G-100凝膠層析、DEAE-DE52陰離子交換柱層析處理后,蛋白酶比活力為 2.2×106U/g,純化倍數達到 96.90。抑制劑實驗、SDS-PAGE與Native-PAGE結果表明,南美白對蝦蝦頭中的主要自溶酶為胰蛋白酶。

圖7 組分ⅡSDS-PAGE(注:“ck”為標準胰蛋白酶,“樣”代表組分Ⅱ)

[1] MeunpolO,HallM R,KapoorV.Partial characterisation and distribution of kynurenine aminotransferase activity in the Black Tigerprawn(Penaeusm onodon)[J].Comparative Biochemistry and Physiology PartB:Biochemistry and MolecularBiology,1998,120(1):139-143.

[2] Zhan W B,Wang X J,Chen J,et al.Elimination of shrimp endogenous alkaline phosphatase background and development of enzyme i mmunoassays for the detection of white spot syndrome virus(WSSV)[J].Aquaculture,2004,239(1-4):15-21.

[3] 沈文英,胡洪國,潘雅娟 .溫度和 pH值對南美白對蝦(Penaeus vannmei)消化酶活性的影響[J].海洋與湖沼,2004,35(6):543-548.

[4] 王淑洪,陳昌生,劉志勇,等 .南美白對蝦幼體消化酶活力的初步研究[J].廈門大學學報:自然科學版,2004,43(3):389-392.

[5] 黃曉鈺,劉鄰渭 .食品化學綜合實驗 [M].北京:中國農業大學出版社,2002:129-131.

[6] Klomklao S,Benjakul S,Visessanguan W.Comparative studies on proteolytic activity of splenic extract from three tuna species commonly used in Thailand[J].Journal of Food Biochemistry,2004,28(5),355-372.

[7] Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227(5259):680-685.

[8] 陳毓荃 .生物化學實驗方法與技術[M].北京:科學出版社,2002:95-97.

[9] 張龍翔 .生物化學實驗方法與技術 (第二版)[M].北京:高等教育出版社,1997:170-173.

[10] Benjakul S,Leelapongwattana K,VisessanguanW.Comparative studyon proteolysisof two speciesof bigeye snapper,Priacanthus macracanthus andPriacanthus tayenus[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2003,83(9):871-879.

[11] Klomklao S,Benjakul S,VisessanguanW,et al.Purification and characterization trypsins from the spleen of skipjack tuna(Katsuwonus pelam is)[J].Food Chemistry,2007,100(4):1 580-1 589.