從腐敗食品中分離的乳酸菌生物被膜形成的影響因素

謝麗斯,張宏梅,劉學祿,張文艷,黃寶威,許佳晶,鄭添信,劉彥蘭

乳酸菌 (LAB)作為發酵劑廣泛應用于乳制品、肉制品、腌制制品等的食品加工,使這些食品具有各種獨特風味。但另一方面,一部分乳酸菌 LAB也可引起食品的腐敗變質[1],如蔬菜、肉類食品腐爛變質。而且,引起食品變質的 LAB均能耐受不同的環境選擇壓力[2]。生物膜是指細菌粘附于物質接觸表面,分泌大量胞外多聚糖基質,脂質蛋白等,包裹自身形成的微生物群落[3]。國外已有一些關于某種乳酸菌生物成膜的研究報道,但國內相關研究尚少。本研究是從腐敗變質的食品中分離篩選乳酸菌,了解不同培養條件下 LAB生物被膜形成的情況,為 LAB生物成膜引起食品變質提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品材料

自然環境中發酵腐敗的蔬菜 3份:豆角、筍、蘿卜 ,腌豬肉 1份。

1.1.2 培養基及試劑

改良MRS培養基配方參見文獻 [4],革蘭氏染色液,95%乙醇,蒸餾水,0.04%溴甲酚綠酒精溶液,1%結晶紫。

1.1.3 實驗器材

96孔平底細胞培養板 (655180):德國 Greinerbio-one公司;酶標儀 (Model 68O):BioRad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理

參照文獻 [5]。

1.2.2 腐敗食品中乳酸菌的分離

取發酵腐敗蔬菜及腌肉預處理→10倍稀釋法→取樣品稀釋液 250μL涂布于含 0.04%溴甲酚綠的改良MRS固體培養基平板→37℃生化培養箱中培養24 h→挑取出現黃色斑點且有溶鈣圈的單菌落→反復在培養基上劃線純化→單菌落菌株→甘油保存菌株于 -20℃。

1.2.3 乳酸菌鑒定

革蘭氏染色鏡檢和接觸酶實驗按文獻[4]的方法,乳酸菌產生乳酸的定性檢測采用紙層析法,具體參見文獻 [6],以 1.5%的標準乳酸溶液和 1.5%的標準乙酸溶液分別作為陽、陰性對照。

1.2.4 微孔板法測定生物被膜光密度值 (OD值)

將分離篩選出的乳酸菌活化,37℃培養 48h后,取菌懸液 1μL加入含有改良 MRS液體培養基100μL/孔的標準 96孔板 ,比例為 1∶100,空白對照為未接菌的MRS培養基。培養結束后用酶標儀測定波長 630 nm處的光密度值OD1,倒掉培養基,用蒸餾水水洗 3次去除浮游菌,微孔板在室溫下干燥 2h,加入1%結晶紫 100μL/孔,放置 20 min后,蒸餾水水洗6～7次去除孔壁染液直至水洗液為無色,孔板在室溫下干燥 30 min,加入 95%乙醇 100μL/孔,微量振蕩器上振蕩 30 min后,用酶標儀測定OD630nm,OD2,平行實驗 3次。黏附率為B,可計算為:

OD1c,OD2c為空白對照吸光度值,B＜0.1為不黏附,B≥0.1為黏附成膜,0.1＜B＜1為中等強度黏附成膜,B＞1為強黏附成膜。

1.2.5 培養條件對LAB生物膜生長的影響

在已加入 100μL MRS培養基的 96孔板中接種LAB1μL,將培養板分別置于 25,30,37,42℃培養 24,48,72 h,平行實驗 3次;以 100μL未接菌懸液的孔作為空白對照進行微孔板法光密度測量;將培養基pH分別調至 4.0,6.8,8.0,重復 1.2.4操作。

1.2.6 不同濃度葡萄糖對LAB生物膜生長的影響

在 96孔板板中分別加入含不同濃度的葡萄糖(分別設為 2,4,8,16,32,64,128 mg/mL)的 MRS培養基 100μL,分別接種,在 25,30,37,42℃培養 48 h,測定B值。

1.2.7 不同濃度 NaCl對 LAB生物膜生長的影響

在 96孔板板中分別加入含不同濃度的 NaCl(分別設為 1.5,3,6,12,24,48,96 mg/mL)的 MRS培養基 100μL,分別接種,在 25,30,37,42℃培養 48 h,測定B值。

2 結果與分析

2.1 發酵食品中 LAB菌株篩選結果

分離得到 8株菌,經革蘭氏染色鏡檢、接觸酶反應和乳酸定性實驗,初步確定 8株乳酸菌。肉類分離菌編號為 L1,L2,蔬菜類分離菌編號為 L3,L4,L5,L6,L7,L8。

2.2 溫度、時間和 pH對 LAB生物被膜形成的影響

37℃時,MRS培養基中乳酸菌在不同培養時間的成膜情況如圖1所示。表明 37℃下 24 h和 48 h培養,B增加趨勢平緩,培養 72 h后,B顯著增加。且62.5%(5/8)菌株B＞1,呈強粘附成膜。在其他各個溫度下,表現的不同培養時間的成膜趨勢與 37℃條件下相一致。

圖1 培養時間對LAB生物膜生長的影響

在不同培養溫度下,乳酸菌培養 72 h后的生物被膜形成能力如圖2所示。結果表明,25℃和 30℃下,所有的 LAB弱成膜作用或不成膜,L2,L3,L4,L7菌株,在 42℃成膜能力較強,L1,L8菌株在 37℃成膜能力最強。一般來講,隨著溫度的升高,培養時間延長,B值呈增加趨勢,37℃和 42℃有利于促進 8株LAB形成大量生物膜。

圖2 培養溫度對LAB生物膜生長的影響

乳酸菌在不同 pH值情況下的生物被膜形成結果表明,當 pH 4.0時,在各個試驗溫度下,8株 LAB均能成膜,且以 37℃顯著強黏附,30℃下中等強度成膜黏附,25℃各菌株成膜較弱,抑制或完全不成膜。pH 6.8時,42℃成膜較好,pH 8.0時,乳酸菌不生長或不成膜。可見 pH值偏酸性時,有利于LAB生長成膜。

2.3 添加不同濃度葡萄糖對 LAB成膜率的影響

在MRS培養基中添加不同濃度的葡萄糖,在不同溫度條件下,培養 48 h,乳酸菌生物被膜的形成情況如圖3所示。結果表明,42℃,低濃度下,隨著葡萄糖濃度的升高,各個菌株的成膜能力增強,成膜率增加。當葡萄糖濃度大于 8 mg/mL時各個菌株成膜能力降低,成膜率有所下降,濃度為 128 mg/mL時成膜率為 0,抑制 LAB形成生物膜;25℃下,隨著糖濃度的增高,成膜率升高,濃度為 128 mg/mL時成膜率達62.5%(5/8);30℃,葡萄糖濃度為 4 mg/mL時,成膜率最高,當葡萄糖濃度高于 4 mg/mL成膜率下降;37℃下不添加糖成分成膜率最高,隨著糖濃度的增加,成膜率都較低。可見在不同溫度,添加不同濃度葡萄糖下,實驗菌株生物成膜情況不同,兩者對其生物膜形成是相互作用的。此外,額外加入葡萄糖,構建新的營養環境,單純的富于營養并不一定能促進生物被膜的形成,而且在生物被膜的培養過程中,還需要考慮浮游菌和生物被膜菌之間的營養競爭和代謝廢物累積效應。[7]

2.4 不同濃度 NaCl對 LAB成膜率的影響

圖3 不同濃度葡萄糖對 LAB成膜率的影響

培養基中添加不同濃度的 NaCl,乳酸菌在不同溫度下培養 48 h,其生物被膜形成情況如圖4所示。不同的溫度,得到統一的成膜趨勢。即在低濃度NaCl條件下,隨著鹽濃度升高,菌株成膜能力增加,成膜率上升。當 NaCl濃度大于 24 mg/mL時,隨著濃度增加,抑制菌株成膜。

圖4 不同濃度 NaCl對 LAB成膜率的影響

3 結論

研究發現,不同培養條件 (溫度、時間、pH值)、不同營養條件 (葡萄糖、鹽濃度)能影響 LAB生物膜的形成。37℃和 42℃的培養溫度,有利于 LAB生物膜的大量形成,低溫不利于生物膜的形成。LAB本身產乳酸,在 pH偏酸性下,均能生長,且在 37℃和42℃下成膜效果顯著。pH值 8為偏堿性,LAB抑制成膜或完全不成膜。添加糖成分,有利于促進 LAB生物膜形成,高溫,高濃度糖成分,抑制 LAB生物成膜。低濃度的 NaCl可促進 LAB形成生物膜,但高于濃度 2.4%時,就抑制 LAB成膜。不同 LAB菌株對不同葡萄糖濃度成膜效果不同,且與溫度交互作用。可能在培養過程中,浮游菌和生物被膜菌之間的營養競爭和代謝廢物的累積。因此,在食品加工工業中為了有效預防自然環境中乳酸菌造成食品的腐敗變質,應盡可能做好食品原材料的清洗或防腐處理,可添加高濃度的 NaCl和保持低溫來進行食品保藏。而且對于加工設備和包裝材料也應進行清洗殺菌處理,減少糖分殘余,避免LAB生物膜形成。

[1] Naitou S.Nyusankin ni yoru shyokuhin no henpai to ozonni yoru boushi gijyutsu[J].Antibact Antifung,1999,27:171-181.

[2] Hiromi Kubota,Shouko Senda,Nobuhiko Nomura.Biofilm formation byLactic acid bacteria and resistance to environmental stress[J].The Society for Biotechnology,2008,106(4):381-386.

[3] 李燕杰,杜冰,董吉林,等,食品中細菌生物被膜及其形成機制的研究進展 [J].現代食品科技,2009,25(4):435-437.

[4] 凌代文,東秀珠.乳酸菌細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業出版社,1999:208-210.

[5] 張宏梅,李發俊,劉學祿,等.部分腌漬食品中乳酸菌的分離與耐藥性分析[J].食品與發酵工業,2010,36(4):25-27.

[6] 汪 紅,曹 瑜,羅時寧,等.四川泡菜乳酸菌的分離鑒定及其特性研究[J].四川大學學報:自然科學版,2008,45(6):1 509-1 512.

[7] 段韻涵,韓北忠,楊葆華,等.培養條件對金黃色葡萄球菌生物被膜生長的影響[J].中國釀造,2008(3):17-20.