飲料中腸桿菌科細菌污染情況分析*

王洋，周幗萍

(武漢工業學院生物與制藥工程學院，湖北武漢，430023)

腸桿菌科微生物為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，需氧或兼性厭氧，廣泛分布于環境中。據細菌學新的分類，腸桿菌科包括腸道病原性和非病原性的埃希氏菌屬(Escherichia)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、變形菌屬(Proteus)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、致病桿菌屬(Xenorhabdus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、歐文氏菌屬(Erwinia)等41 個菌屬［1］。

由于其分布廣泛，能快速厭氧發酵糖類，產酸產氣，所以一旦污染到飲料產品中會迅速生長，導致發生漲罐、變酸、變味、混濁等現象。盡管該類細菌都是不耐熱的，但是實際生產中經常發現有該科微生物的污染，特別是冷灌裝產品中很常見。現就近3年發生的5個案例中腸桿菌科細菌的污染情況進行分析，希望對預防和排查類似污染起到參考作用。

1 材料與方法

1.1 樣品

2009－2011年數家飲料生產企業送檢的5種不同變質樣品。案例1:2009年9月河南某企業送檢PET瓶裝綠茶樣品(冷灌裝);案例2:2010年8月湖北某企業送檢的利樂包裝復原乳飲料樣品(熱灌裝);案例3:2010年9月北京某企業PET瓶裝綠茶飲料(冷灌裝);案例4:2011年5月湖北省某企業送檢PET瓶裝奶茶樣品(冷灌裝);案例5:2011年4月湖北省某企業送檢PET瓶裝蜜橘飲料(冷灌裝)。

1.2 培養基

平板計數瓊脂(PCA);孟加拉紅培養基(虎紅培養基);伊紅美蘭瓊脂(EMB)。

1.3 材料

PCR 主要試劑如:PCR Buffer、Mg2+、Taq酶和Goldview熒光染料為TaKaRa產品，OMEGA bio-tek PCR及酶反應產物純化試劑盒。

1.4 儀器設備

英國 TECHNE TC-312 PCR儀;上海三申(YM50AI)全自動滅菌鍋;蘇凈安泰SW-CJ-1FD無菌操作臺;DYY8B型穩壓電泳儀，北京市六一儀器廠;SYNGENE凝膠圖像分析系統;上海安亭TGL-16C離心機。

1.5 實驗方法

1.5.1 樣品中微生物的檢測與計數［2］

采用平板菌落計數法，在PCA培養基上進行樣品中細菌總數的測定。在37℃培養1 d后計數，并進行單菌落的分離和純化。

1.5.2 分離菌株的 16S rDNA［3］和rpoB序列分析［4－6］

菌裂解液的制備:挑取純化單菌落，加入裝有50 μL無菌去離子水的PCR管中，混勻，PCR儀上94℃保溫10 min裂解，12 000 r/min離心5 min，將上清液轉入微量離心管內，制成菌裂解液，4℃保存。

PCR體系和條件:50 μL PCR體系:Taq酶0.25μL;10x PCR Buffer 5 μL;Mg2+3 μL;2.5 mmol/L 的dNTP 4 μL;2 個10 mmol/L 引物各1 μL;菌裂解液模板 5 μL;無菌去離子水 33.75 μL。

16S rDNA通用引物27F-AGAGTTTGATCATGGCTCAG和804R-CTACCAGGGTATCTAATC;PCR條件為:94℃裂解5 min;94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 60 s(27F-804R)，循環35 次;72℃ 7 min。

rpoB引物rpoB-F-CAGTTCCGCGTTGGCCT和rpoB-R-CCTGAACAACACGCTCGGA;PCR條件:94℃裂解 5 min;94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 70 s，循環 30次;72℃ 7 min。

PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldview染色，凝膠成像分析儀觀察PCR擴增結果。

PCR產物的純化和測序:采用OMEGA bio-tek PCR及酶反應產物純化試劑盒，按操作說明書純化PCR產物，送上海生工生物工程有限公司測序。

序列比對:在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進行BLASTN比對。

2 實驗結果

2.1 樣品的理化指標

樣品均有均勻混濁、產氣、脹瓶/袋現象，pH值有所下降。微生物檢測指標見表1。

表1 5個案例中變質樣品的微生物指標

2.2 污染菌的培養特性與顯微形態分析［7］

5個案例中共分離出11個菌株，具有相似的特征，即在EMB培養基上生長良好，24 h即可形成菌落，菌落淺粉色、紫色;在PCA培養基上生長迅速，24 h形成白色、黃色、微黃色，半透明、濕潤、光滑的小菌落。顯微觀察他們的形態為單個、分散的桿菌，長短不一，見圖1、圖2、圖3和圖4。

2.3 分子生物學鑒定結果

圖1 案例1中的污染菌

圖2 案例4中的污染菌(陰溝腸桿菌)

圖3 案例5中污染菌(陰溝腸桿菌)

圖4 案例5中的污染菌(陰溝腸桿菌)

5個案例中分離的主要污染菌11株經過16S rDNA測序比對后，與腸桿菌科微生物序列相似度最高，Max Identity達99% ～100%，鑒定為腸桿菌科Enterobacteriaceae細菌。其中案例4中1個分離株和案例5中的2個分離株進行了進一步的rpoB基因PCR擴增、測序、BLASTN序列分析，兩者都與陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)細菌的rDNA序列相似性達99%，被進一步鑒定為陰溝腸桿菌(E.cloacae)。

2.4 生產線排查結果

因為腸桿菌科細菌不耐熱，所以它們在飲料工業中的污染來自于殺菌后的二次污染，而且食品工業中腸桿菌科污染源頭多數與水有關。結合微生物分析結果，對生產線排查發現，案例1的污染來自少量水(非無菌水)滲漏到無菌灌裝線的無菌空氣過濾器中，由無菌空氣將水中的細菌帶入成品中。案例2是因為機器老化，包裝的封口溫度過高，可能引起包裝出現細小裂隙，由冷卻水帶入成品。案例3中除了腸桿菌污染以外，還發現了芽孢桿菌和少量霉菌的污染。因為霉菌菌相組成為:枝孢霉、交鏈孢霉、青霉、毛霉等，和空氣中霉菌的菌相高度一致，推測污染源為空氣，通過更換空氣過濾器也解決了污染［8］。案例4發現，問題產品雖然檢測時氣密型正常，但是包材表面有劃傷，污染樣品中也分離到少量霉菌:曲霉和青霉為主。推測可能是灌裝時出現細小、短暫的裂隙，空氣污染導致的。案例5，是新灌裝生產線的部分灌裝頭存在不暢和滲漏導致污染。

3 結果與討論

目前16S rDNA序列比對已被廣泛用于細菌鑒定分類，但由于該基因的保守性，在某些物種如:腸桿菌科中不能準確鑒定到種和屬［4］。但是腸桿菌科中包括沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、腸桿菌屬、克羅諾屬(Cronobactergen.nov.，原阪崎腸桿菌Enterobacter sakazakii)、變形菌屬和埃希氏屬等有許多常見的食源性致病菌，對食品安全影響很大，實際工作中希望能進一步鑒定。此時，結合其他持家基因的分析就非常重要，如:rpoB或dnaJ。

編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因目前已成為系統發育分析和細菌鑒定的核心基因候選者，尤其是在研究親緣關系很近的菌株時。與16S rDNA基因分析相結合，rpoB基因序列分析有助于定義細菌的新種，完善細菌群落分析，同時可以監控利福平抗性突變［4－6］。通過16S rDNA序列分析，案例4中1個分離株和案例5中分離的2個菌株是腸桿菌科細菌，再通過rpoB序列分析就準確鑒定到種—陰溝腸桿菌(E.cloacae)。

陰溝腸桿菌屬腸桿菌屬，為需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。腸桿菌屬腸桿菌是最常見的環境菌群，但不是腸道常居菌群，是條件致病菌。陰溝腸桿菌是最常見的條件致病菌之一，常可從臨床標本中分離到，如泌尿道、呼吸道和傷口感染有關，陰溝腸桿菌導致食物中毒也曾有報道［9－11］。

腸桿菌科微生物廣泛存在于水、土壤等外界環境中，因此在飲料加工中很容易被污染，因其不耐熱，所以在飲料滅菌時無法存活，成品中檢出腸桿菌科微生物，來自于滅菌后加工過程的二次污染［10］。腸桿菌屬細菌經常會污染到食品中，在小作坊式生產過程中，一般是來自與操作工人手的直接接觸，特別是在從業人員未做好必要的個人衛生時。考慮到大企業的正常飲料生產中一般操作工人不會與物料發生直接接觸，水源的污染是可能性最大的污染途徑。這5個案例中3個的污染源頭都是水，只有案例3和4是個例外，污染菌來自車間內濕潤的空氣。

近來由于無菌冷灌裝產品的包材成本低、顏色淺、風味好、營養物質損失少，所以受到飲料行業的青睞。但是，低溫灌裝環節一旦出現任何問題都可能導致大批產品污染，最常見的是腸桿菌和芽孢桿菌類的污染問題。芽孢桿菌因為耐熱而在殺菌后殘留。而腸桿菌細菌污染，來自殺菌后二次污染，污染源可能來自水和空氣。這兩者均具有良好的流動性和滲透性，而且在生產線上無處不在，一旦灌裝設備或包材出現哪怕是短暫的細小裂隙都會帶入細菌，非常難以防范和排查。而該類微生物多數是條件致病菌，需要重視其對食品安全的影響。

［1］ Garrity G M．Bergey＇s Manual of Systematic Bacteriology［M］.(2版)．New York:Springer，2001．

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［3］ 李世東，肖云，劉志國，等.1例奶茶中污染菌的分析鑒定［J］．中國釀造，2010，223(10):188 －190．

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