宣威火腿中生物胺的HPLC測定*

廖國周，王桂瑛，曹錦軒，程志斌

1(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，云南 昆明，650201)2(云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，云南昆明，650212)3(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波，315211)4(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，云南昆明，650201)

生物胺是游離氨基酸在肌肉內(nèi)源酶和微生物產(chǎn)生的外源酶催化作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的一類低分子量有機(jī)堿，主要包括酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亞精胺等多種物質(zhì)［1］。適量的生物胺對人體健康有益，但當(dāng)機(jī)體攝入高濃度的生物胺后，會產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，引起頭痛、呼吸紊亂、心悸、血壓變化等不良癥狀，嚴(yán)重情況下可引起大腦出血，甚至死亡［2］。由于其具有潛在的毒性，目前對食品中生物胺的研究已成為熱點。

宣威火腿是云南省傳統(tǒng)名特優(yōu)產(chǎn)品，2001年獲得國家原產(chǎn)地域保護(hù)，它是由在原產(chǎn)地域內(nèi)飼養(yǎng)的含有烏金豬血統(tǒng)的鮮豬后腿在原產(chǎn)地域經(jīng)過修割定形、腌制、堆碼翻壓、洗曬整形、上掛風(fēng)干、發(fā)酵制作而成［3］。長時間的腌制加工和發(fā)酵成熟過程使肌肉蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生復(fù)雜的生物化學(xué)變化，形成干腌火腿的特征風(fēng)味，同時也可能形成生物胺等副產(chǎn)物［4］。本研究旨在通過柱前衍生-HPLC方法測定宣威火腿中生物胺的種類與含量，為進(jìn)一步評價宣威火腿的安全性提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

供試的成品宣威火腿購于昆明當(dāng)?shù)爻小悠凡杉笥冢?0℃貯存待用。

1.2 主要儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀，配置四元泵、真空在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器、Agilent化學(xué)工作站，美國 Agilent公司;色譜柱:ZORBAX XDB－C18(4.6 mm ×250mm，5μm)，美國 Agilent公司;Allegra 64R冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司;Ultra-Turrax T 25 basic分散器，德國IKA公司;超純水儀，美國Millipole公司。

1.3 試劑

色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺標(biāo)準(zhǔn)品與丹磺酰氯均購自Sigma公司;乙腈、丙酮均為色譜純;氨水、高氯酸、NaOH、NaHCO3等均為分析純。

1.4 測定方法

1.4.1 樣品前處理

取5 g宣威火腿樣品加入20 mL的0.4 mol/L高氯酸，以分散器徹底勻漿后在冷凍離心機(jī)中(4℃，3 000 r/min)離心10 min，收集上清液，沉淀物按上述方法再提取1次。將2次收集的上清液用0.4 mol/L高氯酸定容至50 mL。取1 mL定容后的樣品溶液，加入200 μL的2 mol/L NaOH，然后加入300 μL的飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，接著加入2 mL的丹磺酰氯衍生劑(濃度為10 mg/mL，溶劑為丙酮)，并在室溫黑暗中反應(yīng)處理30 min，反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL的氨水以終止反應(yīng)。最后以乙腈定容至5 mL。經(jīng)衍生處理的樣品液用0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾后即可上機(jī)測定。

1.4.2 色譜條件

釆用二元流動相體系:A為水，B為乙腈，其梯度洗脫程序見表1。紫外檢測波長為254nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為 20 μL，柱溫為 40℃。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

50 mg各種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于0.4 mol/L高氯酸中，并定容至50 mL，得1 mg/mL各種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別取各種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用0.4 mol/L高氯酸配制成終濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取 1 mL的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按上述方法進(jìn)行衍生化，并上機(jī)分析，檢測結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 梯度洗脫程序

1.4.4 回收率、精密度和檢測限

準(zhǔn)確稱取相同的宣威火腿肉樣4份，每份5 g，其中3份分別加入質(zhì)量濃度為500 μg/mL的8種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)液100、500、1000 μL，添加水平分別為1 mg/100 g、5 mg/100 g、10 mg/100 g，另 1 份不加，然后再進(jìn)行前處理及高效液相色譜分析(n=6)，扣除樣品中空白試驗生物胺的含量，計算回收率和精密度。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)的定義，本法的檢測限定義為產(chǎn)生相應(yīng)于3倍背景噪音的標(biāo)準(zhǔn)偏差分析信號的濃度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、決定系數(shù)及方法的檢測限

以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為X，以HPLC測得相應(yīng)的峰面積為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，見表2。結(jié)果表明，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)均大于0.99，各組分在0.5～20 μg/mL內(nèi)線性良好。據(jù)檢測限定義可知，亞精胺與精胺的檢測限為0.05 μg/mL，其余6種生物胺的檢測限均為0.1 μg/mL，可以滿足定量分析的需要。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、決定系數(shù)及方法的檢出限

2.2 方法的回收率與精密度

按回收率方法項操作，得到樣品中添加低、中、高3個濃度水平生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)液的回收率和精密度，見表3。結(jié)果可知，8種生物胺的加標(biāo)回收率的變異范圍為81.58%～95.58%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.48% ～5.85%。表明各濃度水平的加標(biāo)回收率和精密度均能達(dá)到檢測要求，說明本方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。

表3 方法的回收率和精密度(n=6)

2.3 宣威火腿中生物胺的種類與含量

圖1和圖2分別為生物胺標(biāo)準(zhǔn)品與宣威火腿樣品的紫外檢測色譜圖。由圖1可知，本檢測方法能有效地分離鑒定8種生物胺，且各組分峰尖銳、峰形對稱，20 min左右生物胺可被全部洗脫。圖2顯示，在與生物胺標(biāo)準(zhǔn)品相同的保留時間里只出現(xiàn)6個峰，分別為苯乙胺，腐胺，尸胺，酪胺，亞精胺與精胺。

由表4可知，在宣威火腿樣品中并未檢測出色胺與組胺，只發(fā)現(xiàn)苯乙胺，腐胺，尸胺，酪胺，亞精胺與精胺6種生物胺，含量在0.37～4.28 mg/100 g，其中精胺含量最高，酪胺次之。目前對于干腌火腿中生物胺的分析報道較少，Wei等［4］在如皋火腿樣品中檢測出7種生物胺，分別是酪胺、苯乙胺、腐胺、精胺、色胺、尸胺和亞精胺，其中精胺含量最高，達(dá)2.65 mg/100 g。Virgili等［5］對意大利干腌火腿中生物胺的測定結(jié)果稍有不同，其中酪胺含量最大，其次是精胺，表明加工條件與前體物含量對干腌火腿中生物胺的種類與含量有重要影響。生物胺的毒性取決于個體的特性及其他胺的存在情況，如腐胺本身沒有毒性，但可作為酪胺與組胺毒性的增效劑［6］。Eerola 等［7］認(rèn)為，血管活性生物胺(色胺、苯乙胺、組胺與酪胺)的總量低于20 mg/100 g是發(fā)酵肉制品具有較高品質(zhì)的指標(biāo)之一。本研究釆用柱前衍生-HPLC方法首次對宣威火腿中生物胺含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)生物胺總量為11.56 mg/100 g，其中血管活性生物胺的含量遠(yuǎn)低于20 mg/100 g。該結(jié)果為進(jìn)一步研究加工過程中生物胺的消長規(guī)律奠定基礎(chǔ)，并為評價宣威火腿的安全性提供依據(jù)。

圖1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的紫外檢測色譜圖

圖2 宣威火腿中生物胺的紫外檢測色譜圖

表4 宣威火腿中生物胺的種類與含量(n=3)mg/100 g

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