固定化微生物技術在海洋溢油生物修復中的應用

王紹良, 鄭 立, 崔志松, 高 偉, 李 倩

(1. 青島科技大學 化工學院, 山東青島 266042; 2. 國家海洋局第一海洋研究所 海洋生態研究中心, 山東青島 266061)

固定化微生物技術在海洋溢油生物修復中的應用

Microorganism immobilized technique and its application in the bioremediation of marine oil spill

王紹良1, 鄭 立2, 崔志松2, 高 偉2, 李 倩2

(1. 青島科技大學 化工學院, 山東青島 266042; 2. 國家海洋局第一海洋研究所 海洋生態研究中心, 山東青島 266061)

海洋石油的勘探開發, 石油加工產品的生產、使用及排放, 海上溢油事故等, 使石油成為海洋環境的主要污染物之一。據估計, 全世界每年約有 1.0×1010kg的石油進入海洋環境中, 中國每年排入海洋的石油達1.15×108kg, 并且呈逐年增長的趨勢[1-2]。2010年4月和7月先后發生的墨西哥灣鉆井平臺漏油事故和大連新港儲油碼頭輸油管道爆炸事故給當地旅游業、水產養殖業及海洋生態環境造成了災難性的損害。這兩次事故將會像歷次溢油事故一樣, 對環境和人類健康產生長期負面影響, 其危害可長達十幾年甚至幾十年[3]。

目前, 消除海洋石油污染的方法主要包括物理修復、化學修復和生物修復。其中, 生物修復(bioremediation)是指通過生物催化降解環境污染物,減少或最終消除環境污染的受控或自發過程[4]。該領域的研究目前多集中在石油污染土壤和城市污水的生物修復方面, 針對海洋石油污染的生物修復研究相對較少[5-6]。

海洋不同于相對靜止的土壤環境和相對封閉的廢水體系, 它是一個運動、開放的系統。海水的流動性、海洋環境的多變性給受污染水體和岸灘的生物修復造成了很大的困難。例如, 海水的流動很容易造成投加的生物修復劑流失, 使區域內降解菌的濃度降低; 外源微生物往往由于對環境變化適應能力弱而在與土著微生物的競爭中處于劣勢。這迫使我們尋求使外源微生物在受污染區域長期穩定存在的有效方法。

微生物固定化技術是采用化學或物理方法, 將游離細胞定位于限定的區域內, 使其保持活性并可反復利用的技術[7]。這種技術具有微生物密度高、作用時間長、抗不良環境能力強、微生物流失少等優點。將石油降解微生物利用固定化技術進行處理制備成固定化石油污染修復菌劑, 可以在一定程度上克服海洋石油污染生物修復方面遇到的困難, 已成為海洋石油污染應急處置中很有前景的研究方向。

目前, 固定化微生物技術已廣泛應用于有機廢水及重金屬廢水污染的治理, 同時研究還涉及大氣和土壤的污染治理[8]。近幾年, 微生物固定化技術也逐漸應用到石油污染的生物修復中, 并展示出良好的治理效果。作者針對該技術及其應用實例進行了介紹, 并提出今后的研究重點, 以期為研究改進海洋溢油生物修復技術提供新的啟示。

1 固定化細胞的制備方法

固定化細胞制備方法按照固定化載體與作用方式的不同, 主要可分為吸附法、包埋法、交聯法和共價結合法等。

1.1 吸附法

吸附法是依靠帶電的微生物細胞和載體之間的靜電、表面張力和黏附力的作用, 使微生物細胞固定在載體表面和內部形成生物膜的方法, 可分為物理吸附法和離子吸附法。此法較為簡便, 活力損失小,但細胞與載體作用力小, 易脫落[9]。

1.2 包埋法

包埋法是將微生物細胞包埋在凝膠的微小空格內或埋于半透膜聚合物的超濾膜內。可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種。凝膠包埋法是將細胞包埋在各種凝膠內部的微孔中而使細胞固定的方法;而半透膜包埋法是將細胞包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內而使細胞固定的方法。此法簡單, 條件溫和, 穩定性好, 包埋細胞容量高[10]。

1.3 交聯法

交聯法是利用雙功能或多功能試劑, 直接與細胞表面的反應基團(如氨基、羥基、巰基、咪唑基)發生反應, 使其彼此交聯形成網狀結構的固定化細胞, 其結合力是共價鍵。此法制備麻煩, 活力損失較大, 但細胞與載體結合較緊[11]。

1.4 共價結合法

共價結合法是使細胞表面上功能團和固相支持物表面的反應基團之間以化學共價鍵的形式連接,從而制成固定化細胞的方法。此法的優點是細胞與載體結合緊密, 不易脫落, 但制備較難, 且活力損失較大[11]。

對用于海洋石油污染生物修復的微生物固定化方法的選擇, 需要考慮的主要因素是：

(1) 固定化方法要對微生物細胞破壞程度小,盡可能保留微生物的活性, 最好能對微生物適應不利環境的能力有所提高;

(2) 固定化方法要有良好的穩定性, 微生物細胞不易脫落;

(3) 固定化方法要有較小的空間位阻, 有利于微生物與石油中各種組分的結合;

(4) 固定化方法要盡量降低成本, 簡化流程, 以利于大范圍應用。

以上4種方法各有優缺點：其中, 共價結合法和交聯法由于制備較難, 活性保留低, 成本高, 細胞無存活力, 空間位阻較大等缺點, 不太適合用于海洋石油降解菌的固定化。而吸附法和包埋法由于具有制備較易, 成本低, 活性保留高, 細胞有存活力等特點, 其應用潛力較大。然而, 吸附法需克服與微生物結合力低, 細胞易脫落的缺點; 而包埋法則需要解決空間位阻較大的問題。

表1 4種固定化方法的比較[12]

2 固定化細胞常用載體

固定化細胞常用載體主要包括有機高分子載體、無機載體和復合載體, 其中有機高分子載體又分為天然有機高分子載體和合成高分子載體。

2.1 有機高分子載體

2.1.1 天然有機高分子載體

天然高分子載體包括海藻酸鹽、明膠、卡拉膠、海綿、瓊脂等, 一般對生物無毒性, 傳質性能好,但強度較低[13]。

其中海藻酸鹽具有化學穩定性好、無毒、包埋效率高且價格低廉等優點, 是一種廣泛應用的固定化介質[11]。但是海藻酸鈣包埋細胞時, 凝膠顆粒的穩定性和機械強度較差, 需要對其固定化工藝進行改進(如組合固定化技術)后才能最終應用于海洋溢油環境修復。

2.1.2 合成有機高分子載體

合成有機高分子載體材料一般強度較大, 但傳質性能差, 在進行固定化時, 由于聚合物網絡的形成條件比較劇烈, 對微生物細胞的損害較大[14]。常見的載體有聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等。聚丙烯酰胺凝膠在包埋細胞時, 由于交聯過程中的放熱以及交聯試劑本身的毒性, 細胞在固定化過程中往往失活[15]。聚乙烯醇凝膠具有機械強度高、化學穩定性好、抗微生物分解、對細胞毒性小、廉價易得等一系列優點, 因而具有較大的利用價值[11]。

2.2 無機載體

無機載體如硅藻土、高嶺土、多孔陶珠、多孔玻璃、氧化鋁、活性炭等, 具有機械強度大、對微生物無毒性、不易被微生物分解、耐酸堿、成本低、壽命長等特性, 因而也是一類重要的載體材料[15]。

2.3 復合載體

由有機載體和無機載體相結合, 以實現性能互補[16]。

對用于海洋石油污染修復的微生物固定化載體的選擇, 主要應該考慮的是：

(1)固定化載體機械強度好, 能在一定時間內抵御波浪的沖刷, 沙石的碰撞摩擦等破壞作用;

(2)固定化載體要無毒無害, 本身對環境不造成污染, 最好是經過較長時期之后能夠自然分解;

(3)固定化載體還要廉價易得, 以利于降低成本。

以上幾種固定化載體中, 比較有應用潛力的是用作包埋法載體的海藻酸鹽、卡拉膠、聚乙烯醇等和用作吸附法載體的硅藻土等。

另外, 隨著研究的深入, 國內外的學者還開發出了一些新型固定化方法用于生物催化劑(包括酶和微生物)的固定化, 如溶膠-凝膠固定化法、膜固定化法、超微載體固定化法、無載體固定化法、親和配基固定化法、絮凝吸附固定化法、組合固定化技術等。其中, 組合固定化技術可以克服單一固定化技術本身所固有的缺點, 揚長避短, 代表了固定化技術的最新方向[17]。但同時也要看到, 組合固定化技術工藝流程較長, 技術要求較高, 又對其廣泛應用會造成一定影響。在實際應用中, 需要根據不同應用環境要求, 綜合考慮所用微生物的特點設計方案。

3 固定化技術在石油污染生物修復方面的應用研究

在石油污染微生物修復方面, 國內外專家已經取得了很多成果, 在實際應用中也取得了一定的功效。但將微生物與固定化技術相結合, 制備固定化微生物修復劑并用于海洋溢油污染修復的研究并不多見。在土壤、廢水等的石油烴(包括多環芳烴)污染生物修復方面, 已經有一些專家開展了將降解菌制備成固定化制劑的研究, 取得的成果和經驗值得借鑒。鑒于微生物環境修復科學內涵的一致性, 其中對土壤石油污染的修復技術可以研究應用于岸灘石油污染的生物修復, 而對廢水石油污染的修復技術可以研究應用于海洋水體石油污染的修復。

張秀霞等[18]采用 PVA—H3BO3法固定化芽孢桿菌屬石油降解菌 Y-13, 并制備成微球制劑。產品具有良好的機械強度、彈性和滲透性、較高的比表面積和孔容, 致密的孔隙結構。實驗證明球形固定化細菌制劑的降解率比游離細菌、片狀的固定化細菌制劑都要高; 固定化細菌對pH值的適應性也比游離菌更強[18]。該方法選擇包埋法, 使用對環境無毒的聚乙烯醇為載體材料, 采用改良的工藝對石油降解菌進行固定化, 并綜合考慮了固定化制劑的機械強度和制備成本。通過加入活性炭來增加載體孔徑, 提高通透性, 減小了傳質阻力, 利用了活性炭本身的吸附作用, 提高了降解效率。

張秀霞等[19]將高效石油降解菌株通過表面吸附固定化方法固定在生物大分子仿生合成得到的納米多孔氧化硅載體上, 構建出固定化微生物制劑, 并進行了土壤污染的模擬實驗。發現固定化微生物對石油污染物的降解率明顯提高。重復降解實驗證明,該方法構建的固定化微生物對石油污染物的降解率保持穩定[19]。該實驗采用的是吸附法固定化技術, 載體與微生物的結合并不牢固, 容易脫落, 但其載體材料無毒無害, 微生物活力損失小, 有應用于海洋環境的潛力。

邵娟等[20]用秸稈做載體固定嗜堿芽孢桿菌降解原油, 其原油去除率高于單純投加菌液或者菌液與秸稈混合物的原油去除率。實驗中還發現加入無機鹽離子能夠促進嗜堿芽孢桿菌更好地固定于秸稈而生長, 從而提高了其原油去除率。該方法采用了廉價易得的農作物秸稈作為載體, 成本低廉, 無毒無污染, 微生物活力損失小, 而且秸稈具有密度小, 可以漂浮的特點, 用于海面浮油的微生物降解將具有十分明顯的優勢; 同時秸稈可以有效吸附油污, 對微生物與石油污染物的有效接觸有很大幫助。

王坤等[21]利用海藻酸鈉包埋法固定化酚類有機物降解優勢菌, 并用于處理焦化廢水, 得到了很好的有機物降解效果, 在特定實驗條件下, 原水樣中的COD降解率達到62%。該方法制得的固定化顆粒機械強度完全能夠滿足污水處理工藝長時間運行的需要[21], 并且采用了多菌株共固定化的方法, 制得了復合微生物固定化菌劑, 可以有效利用不同優勢菌之間的協同降解效應[22], 提高降解有機污染物的范圍和效率。

朱文芳等[23]將高效除油工程菌固定于顆粒活性炭上, 組裝成固定化微生物反應柱, 研究發現該反應柱對含油廢水的降解效果比游離細胞有明顯提高,并發現微生物經過固定化后, 對pH變化的耐受力顯著增強。該方法在處理含油廢水時同時利用了活性炭的吸附作用和微生物的降解作用, 提高了整體的降解效率, 但因需要特殊的廢水處理設備, 在應用于海水石油污染的修復時會有一定的局限性。

許振文等[24]利用海藻酸鈉包埋法固定化銅綠假單胞菌ZW8制成固定化微生物菌劑, 在實驗室條件下進行多環芳烴蒽的降解實驗。實驗結果表明, 與未固定化的菌株相比, 固定化菌株對蒽有更好的降解效果。同時實驗還采用在制備固定化菌劑過程中加入硅藻土作為吸附劑的方法, 提高了固定化細胞降解性能。許振文等[24]認為加入硅藻土細粉, 可以降低固定化細胞的疏漏, 增加細胞在載體中的分散性,還可使固定化顆粒表面吸附更多的底物, 利于菌種分解底物, 從而提高蒽降解率。這一現象也有可能是因為硅藻土的存在增大了載體的孔徑, 提高了通透性, 減小了傳質阻力。

王新[25]等采用聚乙烯醇、海藻酸鈉和活性炭分別對 3種降解菌進行單獨固定和混合固定, 并用于降解有機污染土壤中的多環芳烴芘及苯并[α]芘, 結果顯示, 固定化微生物對污染物的降解效果明顯好于游離菌, 同時混合固定菌的降解效率普遍高于單菌固定的降解效率。該方法采用了混合菌群進行固定化, 利用了微生物之間的協同效應[22], 得到了很好的效果。

王新[26]等同樣采用聚乙烯醇、海藻酸鈉和活性炭對真菌進行了固定化, 并采用蓮藕型載體成功解決了真菌菌絲體較大, 需要一定的生存空間和相對大的好氧空間, 而球形和片形的載體無法滿足的問題。

Quek等[27]利用聚氨酯泡沫塑料(PUF)吸附法固定化Rhodococcussp. F92制成微生物固定化菌劑,并進行了原油和成品油的降解實驗, 結果表明固定化微生物和游離微生物對烷烴的降解效果都能接近90%, 表明該固定化方法對降解菌的降解能力并未造成影響, 同時作者認為聚氨酯泡沫對溢油具有吸附作用, 可以阻止浮油向海灘和海岸線的遷移。

Oh等[28]利用能吸附石油的聚氨酯塑料作為載體固定化石油降解酵母細胞, 并制成可漂浮的泡沫材料, 用來清除溢油污染后的海面油膜。該方法同時利用了聚氨酯的吸附作用和微生物的降解作用。Oh等測定了不同固定化技術條件下微生物降解石油的能力, 包括聚氨酯直接固定化、幾丁質包埋-聚氨酯固定化、緩釋肥包埋-聚氨酯固定化技術。結果表明,各種技術條件下固定化微生物都有著與游離細胞一樣好的石油降解能力, 并發現幾丁質-聚氨酯固定化方法的降解能力可以在較長時間內保持較高水平。該技術結合了幾丁質、緩釋肥、聚氨酯等多種材料,在延長微生物作用時間、提高效率和穩定性等方面取得了較好的效果, 在海面溢油生物修復方面有較大的應用潛力。

Gentili等[29]利用蝦的廢料中的幾丁質和脫乙酰殼多糖薄片分別作為烴類降解菌的固定化載體, 制備固定化制劑。實驗結果表明, 幾丁質和脫乙酰殼多糖可以提高固定化細菌的存活力和降解活性, 用幾丁質構建的菌劑在儲存和生物降解方面都有著很好的表現。該方法所用材料廉價易得, 無污染, 但吸附法結合力較弱, 其應用效果可能會受影響。

Rahman等[30]利用海藻酸鈣包埋法固定化石油烴降解菌群, 實驗結果表明, 固定化過程并未顯著影響微生物的生物降解能力, 并且在 150天的重復使用實驗中固定化生物降解菌群的降解能力也未顯著衰退。該實驗采用多種石油降解菌, 并對固定化菌劑進行了重復使用實驗, 證明了該方法的有效性和穩定性。

Díaz等[31]利用聚丙烯纖維作為載體吸附固定化石油降解微生物菌群MPD-M。結果表明, 固定化顯著提高了微生物菌群對石油的降解率, 并且與游離微生物菌群相比, 固定化微生物菌群在不同鹽度環境中表現得更加穩定。在180 g/L的高鹽環境下, 固定化微生物菌群的降解效果比游離微生物菌群高4～7倍。親油性載體的使用也提高了微生物對石油的利用效率。該技術使石油降解菌群可以在極寬的鹽度范圍內使用, 大大擴展了石油降解菌群的使用范圍和環境適應能力。

4 小結和展望

固定化微生物技術將高效石油降解微生物定位于限定的區域內, 有效克服游離的微生物在海洋溢油污染生物修復過程中容易流失等問題, 提高微生物適應海洋復雜環境的能力, 進而提高溢油修復效果, 其應用前景廣闊。

今后的研究方向主要集中在3個方面：

(1) 尋找合適的固定化載體

應用于海洋溢油污染的固定化載體首先應是環境友好型載體, 其本身對環境無污染; 同時還要具有一定的機械強度; 與微生物結合緊密; 傳質阻力小并且廉價易得。

(2) 開發新的固定化技術

微生物固定化技術要盡可能保持微生物的活性,對微生物細胞破壞程度較小; 還要降低成本, 簡化工藝流程, 以利于大范圍應用; 另外要向復合菌群和組合載體固定化方面開展研究, 充分利用多種微生物之間的協同降解效應和多種載體的優點。

(3) 海洋溢油微生物固定化的應用技術研究

積極開展中試實驗和污染現場實驗, 根據不同海洋環境開發具有針對性的固定化微生物菌劑。例如針對海面溢油的修復開發可以漂浮的固定化菌劑技術, 針對海洋環境中營養鹽缺乏的情況開發固定化菌體-緩釋營養鹽復合制劑等, 最終開發出一整套系統化針對溢油污染的高效生物修復工藝體系, 為溢油污染的治理修復提供有效的技術保障。

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X55 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2011)12-0127-05

2011-02-17;

2011-07-12

國家自然科學基金項目(41076108; 40906062); 公益性行業科研專項經費項目(200705011); 國家海洋局近岸海域生態環境重點實驗室基金項目(201008); 國家海洋局第一海洋研究所基本科研業務費專項資金項目(2010G23)

王紹良(1983-), 男, 山東萊西人, 碩士研究生, 主要從事海洋溢油污染的生物修復技術研究, E-mail：wshlyx@sina.com;鄭立, 通信作者, E-mail：zhengli@fio.org.cn

張培新)