長(zhǎng)牡蠣細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵基因cyclin B3的克隆及其在性腺發(fā)育中的作用

王 桐, 李 莉 闕華勇 張國(guó)范

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

長(zhǎng)牡蠣細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵基因cyclin B3的克隆及其在性腺發(fā)育中的作用

王 桐1,2, 李 莉1, 闕華勇1, 張國(guó)范1

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

首次在長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)中克隆得到細(xì)胞周期蛋白B3(cyclin B3)的cDNA全長(zhǎng)序列和基因組結(jié)構(gòu)序列。cyclin B3基因cDNA全長(zhǎng)2383 bp, 其中編碼區(qū)長(zhǎng)度為1293 bp, 編碼一條含430個(gè)氨基酸的多肽鏈, 氨基酸序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析均表明其為其他物種cyclin B3的同源蛋白, 預(yù)測(cè)的蛋白大小為47.8 kD。cyclin B3基因含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子, 外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目和大小與其物種的進(jìn)化地位相符。Real Time PCR分析表明, 該基因表達(dá)有較強(qiáng)的組織特異性, cyclin B3 mRNA在性腺中的含量最高, 而在外套膜中的含量最少, 前者是后者的 92倍左右; 對(duì)處于不同發(fā)育階段性腺中cyclin B3基因表達(dá)分析結(jié)果顯示, 性腺中cyclin B3 mRNA含量隨性腺發(fā)育程度的提高而提高, 這與其在細(xì)胞分裂和減數(shù)分裂中的作用相符, 同時(shí)也有助于滿(mǎn)足早期胚胎發(fā)育時(shí)期旺盛的細(xì)胞分裂對(duì) cyclin B3蛋白需求。

長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas); 細(xì)胞周期調(diào)控; cyclin B3; 性腺; Real Time PCR

細(xì)胞周期是一個(gè)在 S期進(jìn)行 DNA復(fù)制并在M期進(jìn)行染色體分離的循環(huán)過(guò)程, 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞而言,還有 G1、G2兩個(gè)時(shí)相, 分別為細(xì)胞進(jìn)入 S期和 M期在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方面做必要準(zhǔn)備[1]。細(xì)胞周期的時(shí)相轉(zhuǎn)換是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程, 蛋白激酶或調(diào)控因子如細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依賴(lài)性激酶(Cyclin Dependent Kinase, CDK)、CDK抑制性因子(CDKI)、CDK 活化激酶(CDK Activation Kinase)、PLK(Polo-like Kinase)等組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與其中, 為細(xì)胞周期時(shí)相的有序推進(jìn)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。

周期蛋白 B(cyclin B)是首先在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物海膽中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞周期調(diào)控因子, 以在細(xì)胞周期中其蛋白豐度呈現(xiàn)周期性變化為典型特征, 在細(xì)胞分裂間期積累, 在細(xì)胞分裂期被蛋白酶復(fù)合物APC降解。cyclin B作為調(diào)節(jié)亞基依靠周期蛋白框與CDK1(p34CDC2)組成 MPF(Maturation或 M-phase Promoting Factor)二聚體復(fù)合物[2], 在精母/卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、G1/S和G2/M 轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用[3-8], CDK1的T14、Y15的去磷酸化和T161的磷酸化實(shí)現(xiàn)MPF的活化[9-12]而MPF活性降低依靠CDK1上述氨基酸位點(diǎn)的去磷酸化以及 cyclin B蛋白的泛素化降解途徑[13]實(shí)現(xiàn)。目前已知的MPF的底物有200多種, 如組蛋白H1(histone 1), DNA復(fù)制相關(guān)的基因(cdc6、orc2/6 等)、紡錘體組裝相關(guān)基因(Ase1、Kar3、Kip2/3、Slk19、Stu2等)、微絲聚合相關(guān)基因(Bem1/3)等[14],MPF通過(guò)磷酸化上述底物, 完成細(xì)胞周期時(shí)相的轉(zhuǎn)換或停滯, 實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的增殖和分化、配子減數(shù)分裂,進(jìn)而保證胚胎或機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和生殖等生理過(guò)程的正常進(jìn)行。

長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)是世界上重要海水養(yǎng)殖物種, 也是我國(guó)傳統(tǒng)的四大養(yǎng)殖貝類(lèi)之一, 目前對(duì)長(zhǎng)牡蠣細(xì)胞周期調(diào)控基因克隆方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究中克隆了長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因的cDNA全長(zhǎng)序列和基因組結(jié)構(gòu)序列, 對(duì)其進(jìn)行比較分析,利用Real Time PCR技術(shù)檢測(cè)了該基因在不同組織中的表達(dá)特點(diǎn)并分析了其在性腺發(fā)育中的作用。本研究首次在貝類(lèi)中克隆得到cyclin B3基因, 初步證實(shí)了cyclin B3基因與性腺成熟發(fā)育的密切關(guān)系, 期望對(duì)深入研究雙殼貝類(lèi)性腺成熟機(jī)理和指導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣養(yǎng)殖實(shí)踐能起到一定作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

本研究中所用的牡蠣個(gè)體購(gòu)自青島市南山水產(chǎn)品市場(chǎng), 實(shí)驗(yàn)前選擇活力強(qiáng)、殼長(zhǎng)8.8～11.8 cm的長(zhǎng)牡蠣去凈附著物后在海水溫度19 ℃± 2 ℃的暫養(yǎng)池中充氣暫養(yǎng)7d以上, 每天換水一次并每天3次定時(shí)定量投喂螺旋藻粉餌料, 使其充分適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

外資銀行的爭(zhēng)相布局，其國(guó)際化程度、人力資源等方面的優(yōu)勢(shì)，讓云南的企業(yè)成了最先的受益者，為企業(yè)帶來(lái)了更多選擇。

本實(shí)驗(yàn)研究中所用基因組DNA提取試劑盒、總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海飛捷生物技術(shù)有限公司,M-MLV、DNase I 等購(gòu)自Promega公司, dNTP mix、DNA 片段純化試劑盒、末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)、dCTP、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(含gDNA Eraser)、Real Time PCR試劑盒等購(gòu)自TAKARA公司, 高保真Taq酶、pEASY-T1克隆載體、Trans1-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京TransGen生物技術(shù)有限公司, PCR膠回收試劑盒購(gòu)自 Axygen公司, 實(shí)驗(yàn)所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1), 序列測(cè)定由上海桑尼生物科技有限公司完成。

用test-F和test-R獲得PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序獲得473 bp的片段, 雙序列比對(duì)結(jié)果顯示與待驗(yàn)證EST中對(duì)擴(kuò)引物之間的序列有 99.32%的一致性, 證明該EST的正確性, 可用于cDNA全長(zhǎng)的克隆。

表1 本研究所用到的主要引物序列及用途Tab. 1 Sequences and applications of primers used in this study

1.2 長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆與分析

1.2.1 cDNA的制備

3′RACE 獲得一條長(zhǎng) 1147 bp 的片段, 5′RACE 得到一條長(zhǎng)1082 bp的片段。將上述序列與EST驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接, 獲得長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因全長(zhǎng)cDNA序列(Accession NO. HQ878119), 總長(zhǎng) 2383 bp(含Poly A尾), 其中編碼區(qū)長(zhǎng)度為1293 bp, 終止密碼子為UAG, 編碼1條含430個(gè)氨基酸的多肽鏈。5′UTR長(zhǎng)度為 185 bp, 3′UTR長(zhǎng)度為 880bp, 含有 2個(gè)加尾信號(hào)(AAUAAA), 4個(gè)cyclinA/B mRNA降解敏感性位點(diǎn)(AUUUA)以及 10個(gè) CPE元件(A/UUUUUAU/A)。所編碼的多肽鏈預(yù)測(cè)蛋白大小約為48.7 kD, 等電點(diǎn)為5.56。該多肽鏈含有B3-型周期蛋白特有的結(jié)構(gòu)域, 如中部含有可與MPF的催化亞基 CDK1(p34CDC2)結(jié)合的周期蛋白框, N端第60～68位含有可與泛素結(jié)合進(jìn)而被蛋白酶體降解的的M期B3型周期蛋白降解盒(destruction box)序列RXAFGXIXN, 且降解盒下游有一個(gè)在整條多肽鏈中Lys最豐富的區(qū)域, 第77～107位區(qū)域中共有13個(gè)Lys位點(diǎn)(cyclin蛋白中該區(qū)域平均Lys含量為6個(gè)[13]),在cyclin泛素降解途徑中執(zhí)行與泛素(Ubiquitin)結(jié)合的功能; C端第313～319位有B3-型周期蛋白的典型序列cAMP依賴(lài)的pKA磷酸化相關(guān)區(qū)域FLRRXAK。

1.2.2 一段長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因EST序列的驗(yàn)證

分別選取性腺透明內(nèi)臟團(tuán)完全可見(jiàn)、性腺初現(xiàn)白色且內(nèi)臟團(tuán)可見(jiàn)和性腺白色且基本遮蓋內(nèi)臟團(tuán)但光學(xué)顯微鏡下仍不能分辨性別的長(zhǎng)牡蠣各 3只, 編號(hào) Gn1、Gn2、Gn3, 剪取各組性腺組織塊, 組內(nèi)混合在一起并提取其總 RNA, 進(jìn)行完整性檢測(cè)后反轉(zhuǎn)錄獲得實(shí)驗(yàn)用cDNA模板。Real Time PCR檢測(cè)各性腺發(fā)育時(shí)期的 cyclin B3基因表達(dá)水平, 方法同前,收集并用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因cDNA全長(zhǎng)的克隆和序列分析

陽(yáng)光物業(yè)歷經(jīng)多年的跨越式發(fā)展，形成了國(guó)有企業(yè)物業(yè)管理獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。分公司以天津大廈為依托，為天津石油單位提供優(yōu)質(zhì)服務(wù)，提升陽(yáng)光物業(yè)品牌的市場(chǎng)影響力和知名度，讓“陽(yáng)光品牌”在天津扎根，為企業(yè)的穩(wěn)健發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。

提取 1.2中長(zhǎng)牡蠣個(gè)體鰓組織的基因組 DNA,電泳法檢測(cè) DNA的純度和完整性。 利用獲得的cyclin B3 cDNA全長(zhǎng)序列和長(zhǎng)牡蠣基因組序列, 在cyclin B3基因編碼區(qū)和3′和5′UTR側(cè)翼序列分別設(shè)計(jì) 4對(duì) Overlap PCR引物 DK-F1/R1、DK-F2/R2、DKF3/R3、DKF4/R4, 將獲得的 PCR產(chǎn)物回收并克隆測(cè)序, 用 DNAMAN6.0軟件完成片段拼接, 獲得cyclin B3基因的外顯子-內(nèi)含子序列, 利用cyclin B3基因cDNA序列和其基因組序列在NCBI網(wǎng)站上的Splign內(nèi)含子分析工具分析獲得cyclin B3基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu), 并對(duì)cyclin B3的結(jié)構(gòu)進(jìn)行種間比較分析。

用DNAMAN 6.0軟件將測(cè)序結(jié)果與EST驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行拼接, 得到基因的cDNA全長(zhǎng), 并通過(guò)重測(cè)序消除不確定堿基。通過(guò)BLASTx比對(duì), 在NCBI網(wǎng)站上查找相關(guān)物種的 cyclin B3蛋白氨基酸序列, 用DNASTAR 7.0 軟件進(jìn)行蛋白大小等性質(zhì)預(yù)測(cè), 用Mega 4.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.3 長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因基因組結(jié)構(gòu)序列的克隆和分析

5′序列的獲得：根據(jù) EST驗(yàn)證結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)巢式 PCR 引物：5′GSP1 和 5′GSP2。用 DNA 片段純化試劑盒純化反轉(zhuǎn)錄的cDNA。用TdT在cDNA3′末端加上Poly C尾巴。以加尾后的cDNA作為模板, 以AP-G10/5′GSP1和 AP/5′GSP2為引物進(jìn)行巢式 PCR,將獲得的產(chǎn)物回收測(cè)序, 方法同前。

1.4 長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因RNA水平表達(dá)特點(diǎn)分析

長(zhǎng)牡蠣 cyclin B3基因的組織表達(dá)分析在 ABI 7500 Fast Real Time PCR儀上實(shí)現(xiàn)。分別取3只長(zhǎng)牡蠣得鰓、外套膜、血淋巴、性腺(白色、基本遮住內(nèi)臟團(tuán), 但光學(xué)顯微鏡下仍不能分辨其性別)、閉殼肌、消化腺, 將每種組織混在一起, 提取上述組織的總RNA, 瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA完整性, 反轉(zhuǎn)錄獲得Real Time 實(shí)驗(yàn)用cDNA模板。cyclin B3基因特異性引物為 RT-F/R, 內(nèi)參引物為 EF-F/R, 用TAKARA Premix Ex Taq (Perfect Real Time) Real Time PCR試劑盒配成體系上機(jī), 反應(yīng)程序?yàn)?94℃30s (94 ℃ 5s、60℃ 30s)×40個(gè)循環(huán), 收集并用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

通過(guò)BLASTx同源比對(duì), 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中找到一段長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因的EST序列(Accession NO.CU998380.1), 通過(guò)這段 EST序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物test-F和test-R, 以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng), 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳、切膠、回收純化目的片段、將目的片段連接到pEASY-T1載體中、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞后送測(cè)序, 用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。

3′端序列的獲得：根據(jù) EST驗(yàn)證結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)巢式 PCR 引物 3′GSP1 和 3′GSP2。以用 3′CDS 為引物反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA為模板, 以 3′GSP1/UPM 和3′GSP2/NUP為引物進(jìn)行巢式PCR, 將獲得的產(chǎn)物進(jìn)行回收測(cè)序, 方法同前。

2 結(jié)果與分析

2.1 cyclin B3基因全長(zhǎng)cDNA的克隆與序列分析

2.1.1 EST序列的驗(yàn)證

觀察組患者治療前MMSE評(píng)分為（13.96±4.95）分，對(duì)照組為（14.01±4.93）分，兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；治療后，觀察組MMSE評(píng)分為（21.52±3.26）分，對(duì)照組為（18.27±2.98）分，兩組均較治療前明顯改善（P＜0.05），且觀察組改善程度更為明顯（P＜0.05）。

2.1.2 cyclin B3基因cDNA全長(zhǎng)的克隆和序列分析

取長(zhǎng)牡蠣性腺組織, 用飛捷組織RNA抽提試劑盒提取其總 RNA, 瓊脂糖凝膠電泳法驗(yàn)證其完整性和DNaseⅠ去除混雜的基因組DNA后用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 合成的第一鏈 cDNA保存于－20℃冰箱中備用。

將推導(dǎo)的長(zhǎng)牡蠣 cyclin B3氨基酸序列與水螅(Hydra magnipapillata, Accession NO. XP_002160446.1)、佛羅里達(dá)弓背蟻(Camponotus floridanus, Accession NO. EFN74068.1)、海星(Marthasterias glacialis,Accession NO. CBG91877.1)、斑馬魚(yú)(Danio rerio,Accession NO. AAI54345.1)、爪蟾(Xenopus laevis,Accession NO. NP_001079361.1)、雞(Gallus gallus,Accession NO. NP_990570.1)的cyclin B3氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì), 發(fā)現(xiàn)上述6個(gè)物種與長(zhǎng)牡蠣cyclin B3氨基酸序列一致性在40%～45%之間, N端和N端近中部的氨基酸長(zhǎng)度和氨基酸序列變化較大, 而 C端和 C端近中部的保守性明顯較高, 七個(gè)物種都具有上述cyclin B3蛋白特征性的結(jié)構(gòu)域。詳見(jiàn)圖1和圖2。

限于篇幅的原因，對(duì)于邏輯斯蒂方程的演繹過(guò)程與生長(zhǎng)曲線方程的推導(dǎo)從略。邏輯斯蒂方程的基本形式為和μ都是經(jīng)驗(yàn)參數(shù)，只能按所得數(shù)據(jù)用邏輯斯蒂方程本身擬合來(lái)予以確定。在求導(dǎo)邏輯斯蒂方程時(shí)，參數(shù)K和μ可以用最小二乘法求得，而對(duì)于Wm，可取3對(duì)觀測(cè)量(t1,w1)，(t2,w2)，(t3,w3)代入求得。

通過(guò)鄰接法構(gòu)建了cyclin B3基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(bootstrap test中replications值設(shè)為1000000), 如圖3所示。脊椎動(dòng)物cyclin B3聚為一個(gè)大的分支, 而長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因的進(jìn)化地位與其物種的進(jìn)化地位相似, 總體上處于無(wú)脊椎動(dòng)物的大分支上, 并且與水螅、旋毛蟲(chóng)聚在一個(gè)次分支而與佛羅里達(dá)弓背蟻、印度跳蟻和海星處在不同的進(jìn)化分支上。

2.2 長(zhǎng)牡蠣 cyclin B3基因組結(jié)構(gòu)的獲得與分析

用Overlap PCR的方法獲取了長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因的基因組結(jié)構(gòu)信息, 共獲得5347 bp的該基因的基因組序列信息(Accession NO. HQ878120), 將其與2.1中獲得的cDNA全長(zhǎng)序列用NCBI上的Splign內(nèi)含子在線分析工具進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)該基因共含有 10個(gè)外顯子和 9個(gè)內(nèi)含子, 且內(nèi)含子-外顯子邊界均符合“GT-AG”的剪接規(guī)則。不同物種cyclin B3的基因組結(jié)構(gòu)比較顯示, 隨物種的進(jìn)化, 外顯子和內(nèi)含子數(shù)逐漸增多, 長(zhǎng)牡蠣的cyclin B3基因的外顯子數(shù)目和編碼蛋白大小處于過(guò)渡階段, 至哺乳類(lèi)時(shí)數(shù)目穩(wěn)定在 12個(gè), 編碼蛋白的大小也相應(yīng)增大; 除個(gè)別例外以外, 內(nèi)含子隨物種進(jìn)化逐漸變長(zhǎng)。對(duì)昆蟲(chóng)綱的埃及斑紋(Aedes aegypti)和致倦庫(kù)蚊(Culex quinquefasciatus)等的cyclin B3基因組結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),昆蟲(chóng)綱(至少是雙翅目昆蟲(chóng))的外顯子-內(nèi)含子進(jìn)化不符合上述規(guī)律。詳見(jiàn)圖4、表2和表3。

根據(jù)Zhang Y，Shao J H等[12,13]的方法，并稍作修改，使用掃描電子顯微鏡觀察、記錄添加刺槐豆膠以及空白組冷凍面團(tuán)凍藏不同時(shí)間的微觀結(jié)構(gòu)。將凍藏后樣品放入1 cm2大小的正方形模具中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥結(jié)束后用導(dǎo)電雙面膠固定到樣品臺(tái)上進(jìn)行樣品表面噴金，噴金后置于SEM下觀察（電壓10 kV），拍攝放大倍數(shù)2000倍的圖像。

圖1 長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因cDNA序列全長(zhǎng)及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 The nucleotide and deduced amino acid sequence of Crassostrea gigas cyclin B3 cDNA

圖2 長(zhǎng)牡蠣與6個(gè)物種的cyclin B3氨基酸序列比對(duì)Fig. 2 Alignments of the deduced amino acid sequence of Crassostrea gigas cyclin B3 with six other species

圖3 cyclin B3基因鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree of cyclin B3 gene

2.3 長(zhǎng)牡蠣cyclin B3基因RNA水平上表達(dá)特點(diǎn)分析

Real Time PCR分析cyclin B3組織表達(dá)特點(diǎn)如圖5所示, 該基因在長(zhǎng)牡蠣各器官中均有表達(dá), 但也呈現(xiàn)出較強(qiáng)的組織特異性, 其中在性腺中表達(dá)量最多, 其次是血淋巴, 表達(dá)量最少的組織是外套膜, 前兩個(gè)組織中cyclin B3基因的表達(dá)量分別約是外套膜的92倍和12倍。LSD法多重比較結(jié)果顯示, 血淋巴與其他組織cyclin B3基因表達(dá)差異顯著(P＜0.05),性腺與其他組織 cyclin B3基因表達(dá)差異極顯著(P＜0.01)。性腺和血淋巴是細(xì)胞分裂非常旺盛的部位,該基因在這兩種組織中的高表達(dá)特點(diǎn)與它在體細(xì)胞有絲分裂和生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的重要作用是相一致的。

圖4 長(zhǎng)牡蠣cyclin B3的基因組結(jié)構(gòu)Fig. 4 Genome structure of Crassostrea gigas cyclin B3 gene

圖5 長(zhǎng)牡蠣cyclin B3組織特異性表達(dá)分析Fig. 5 Tissue-specific expressions of Crassostrea gigas cyclin B3

不同發(fā)育階段的長(zhǎng)牡蠣性腺中cyclin B3基因表達(dá)特點(diǎn)如圖6所示, 該基因的mRNA在細(xì)胞中含量隨性腺發(fā)育程度的提高而提高, 在透明狀性腺中的最低(Gn1)而在白色且基本遮蓋內(nèi)臟團(tuán)的性腺(Gn3)中最高(后者約為前者的 24倍), LSD法多重比較結(jié)果顯示, Gn3與Gn1和G2 cyclin B3基因表達(dá)差異均極顯著(P＜0.05)這與其在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂中的作用是一致的, 同時(shí)也為早期胚胎細(xì)胞的有絲分裂儲(chǔ)備物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖6 三個(gè)不同發(fā)育階段長(zhǎng)牡蠣性腺cyclin B3基因表達(dá)特點(diǎn)分析Fig. 6 Expressions of Crassostrea gigas cyclin B3 in gonad at three development stages

3 討論

3.1 cyclin B3基因組結(jié)構(gòu)的進(jìn)化

通過(guò)對(duì)多個(gè)物種 cyclin B3基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的比較(表2和表3), 發(fā)現(xiàn)該基因基因組結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上存在一定規(guī)律性：(1)隨進(jìn)化外顯子的數(shù)目增多, 到哺乳類(lèi)時(shí)穩(wěn)定在 12個(gè), 蛻皮動(dòng)物至少肢動(dòng)物的進(jìn)化可能另成體系; (2)根據(jù)長(zhǎng)牡蠣 E6～E8、海膽E7～E9及更高級(jí)物種E9～E11可以推斷進(jìn)化過(guò)程中海膽及后續(xù)高等物種的的 E-6是由于某個(gè)事件插入進(jìn)來(lái)的, 長(zhǎng)牡蠣的 E-6(即海膽的 E-7)分拆為高等物種的E7和E8, E6插入及分拆的機(jī)制和原因值得我們深入探索; (3)進(jìn)化中一些外顯子大小逐漸穩(wěn)定下來(lái),如E-7、E-8、E-9、E-10、E-11等; 哺乳類(lèi)的E-5相比于其他物種其大小急劇膨脹, 相應(yīng)編碼的 cyclin B3蛋白也增大很多, 這種進(jìn)化中外顯子膨脹的原因及機(jī)制以及對(duì)基因功能的影響有待深入研究。(4)內(nèi)含子進(jìn)化方面, 其數(shù)目變化規(guī)律與外顯子進(jìn)化是一致的, 在大小上總體上無(wú)脊椎動(dòng)物比脊椎動(dòng)物的內(nèi)含子要小, 脊椎動(dòng)物隨進(jìn)化內(nèi)含子有增大的趨勢(shì),出現(xiàn)了 1萬(wàn)～2萬(wàn)甚至 7萬(wàn)多個(gè)堿基的巨型內(nèi)含子,如何在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)錄如此長(zhǎng)的hnRNA并通過(guò)剪接獲得mRNA以滿(mǎn)足一些細(xì)胞分裂旺盛的組織對(duì)細(xì)胞周期蛋白B3的需求以及保持這種巨型hnRNA在細(xì)胞中穩(wěn)定性的機(jī)制值得更深一步的研究。(5)昆蟲(chóng)在進(jìn)化中外顯子規(guī)律性不是很明顯, 外顯子數(shù)目及大小都與其物種的進(jìn)化地位不符, 昆蟲(chóng)該基因的基因組結(jié)構(gòu)變化較大, 如埃及斑蚊和致倦庫(kù)蚊的外顯子數(shù)有4個(gè)而果蠅卻只有1個(gè), 且編碼的蛋白大小比前兩者大很多, 但編碼的蛋白大小卻相差很大, 產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因及其與節(jié)肢動(dòng)物起源的關(guān)系值得我們更進(jìn)一步的探討。

所謂初中物理課堂教學(xué)的有效方法，實(shí)際上就是教師要建立起高效的初中物理課堂。簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是物理教師在一定的、有限的課堂時(shí)間內(nèi)，能夠通過(guò)各種方式使得物理教學(xué)課程真正、高效地得到推進(jìn)，使每一堂課都能得到最大限度的發(fā)揮，學(xué)生真正將知識(shí)點(diǎn)牢牢地記在腦海里。而要在初中物理課堂當(dāng)中實(shí)施高效教學(xué)，就需要物理教師摒棄古板陳舊的教學(xué)方式，通過(guò)不斷學(xué)習(xí)具備現(xiàn)代教學(xué)理念以及掌握各種高效教學(xué)的方式，使學(xué)生真正提起對(duì)物理的學(xué)習(xí)積極性，實(shí)現(xiàn)學(xué)習(xí)效率的提升。本文將結(jié)合人教版初中物理教材，淺探初中物理教學(xué)中的有效方法。

表2 一些物種cyclin B3基因外顯子(E)的數(shù)目及大小(bp)Tab. 2 The number and size (bp) of exons (E) in cyclin B3 gene in some species

表3 一些物種cyclin B3基因內(nèi)含子(I)的數(shù)目及大小(bp)Tab. 3 The number and size (bp) of introns (I) in cyclin B3 gene in some species

3.2 關(guān)于cyclin B3 mRNA的翻譯調(diào)控和在卵細(xì)胞中的儲(chǔ)備

cyclin B蛋白作為調(diào)節(jié)亞基與CDK1(p34CDC2)的結(jié)合是活化MPF的必要條件, MPF的活化促使細(xì)胞周期從 G2期向 M 期轉(zhuǎn)變; 細(xì)胞分裂的完成伴隨MPF的活性消失, 這是通過(guò)cyclin B的水解實(shí)現(xiàn)的[13],因此, 在蛋白水平上cyclin B蛋白在細(xì)胞中不會(huì)有很高的存量, 滿(mǎn)足分裂細(xì)胞對(duì)cyclin B蛋白的需求主要靠mRNA翻譯水平的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。在貝類(lèi)[15-16]、 昆蟲(chóng)[17]、魚(yú)類(lèi)[18]、兩棲類(lèi)[19-20]、哺乳類(lèi)[21]等動(dòng)物類(lèi)群中的研究發(fā)現(xiàn), 多聚腺苷化(polyadenylation)和去腺苷化(deadenylation)是一種普遍的實(shí)現(xiàn)翻譯調(diào)控的機(jī)制, 其中 mRNA 3’UTR區(qū)的細(xì)胞質(zhì)多聚化元件(CPE)等順式作用元件起了重要作用, 很多反式作用因子如CPEB、Bruno、Pumilio、Bicoid等參與了翻譯調(diào)控過(guò)程的實(shí)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)牡蠣cyclin B3的3’UTR區(qū)有多達(dá)10個(gè)CPE元件(在中華絨螯蟹中為8個(gè)[22], 在日本對(duì)蝦中為4個(gè)[23]), 可見(jiàn)CPE元件在調(diào)控cyclin B3蛋白翻譯過(guò)程的重要作用。在許多多細(xì)胞生物中, 受精后4h內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄沒(méi)有或水平很低, 早期胚胎發(fā)育所需的大量 mRNA主要靠卵細(xì)胞含有的母源性mRNA (保存在mRNA顆粒中)提供[24],因此在性腺發(fā)育過(guò)程中必然也會(huì)積累大量的 cyclin B3 mRNA以滿(mǎn)足早期胚胎發(fā)育需求, 本研究中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)牡蠣cyclin B3 mRNA含量在性腺中含量很高, 也印證了此猜測(cè)。

本研究首次在長(zhǎng)牡蠣中克隆得到 cyclin B3 cDNA全長(zhǎng)和基因組結(jié)構(gòu), 并對(duì)其組織表達(dá)特點(diǎn)及在性腺發(fā)育中的作用進(jìn)行了初步探討, 下一步將通過(guò)蛋白水平的研究進(jìn)一步探討長(zhǎng)牡蠣性腺發(fā)育中cyclin B3蛋白的作用機(jī)理。

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Molecular cloning and characterization of the key regulator of cell cycle cyclin B3 in Pacific Oyster (Crassostrea gigas),and its role in gonad development

WANG Tong1,2, LI Li1, QUE Hua-yong1, ZHANG Guo-fan1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Dec., 25, 2010

Pacific oyster (Crassostrea gigas); cell cycle regulation; cyclin B3; gonad; Real Time PCR

The full length cDNA sequence of cyclin B3 was cloned from Pacific oyster (Crassostrea gigas) for the first time. Cyclin B3 cDNA was 2383 bp in length, containing a 1293bp CDS that encoded a peptide of 430 amino acids with a calculated molecular weight of 47.8 kD. Multiple alignment and converted domain analysis showed that this peptide was a homolog of cyclin B3. The gDNA sequence of cyclin B3 contained 10 exons and 9 introns,which was consistent with the position in evolution ofC. gigas. Expression of cyclin B3 gene was found in all tissues, but also showed a very strong tissue-specific feature; the amount of cyclin B3 in gonad was the highest among tissues, 100 times of mantle, the lowest expression tissue. The mRNA amount of cyclin B3 in gonad increased with the maturation of gonad. The expression implied the important role of cyclin B3 in mitosis, meiosis and early development of embryo.

S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3096(2011)12-0001-09

2010-12-25;

2011-02-25

國(guó)家“863”計(jì)劃資助項(xiàng)目(2006AA10A401); 國(guó)家“973”計(jì)劃資助項(xiàng)目(2010CB126401); 國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(3-53)作者簡(jiǎn)介：王桐(1987-), 男, 山東泰安人, 碩士研究生, 主要從事海洋貝類(lèi)功能基因研究, 電話(huà)：0532-82898726, E-mail：humanexplorer@126.com;闕華勇, 通信作者, 研究員, 電話(huà)：0532-82898713, E-mail：hque@qdio.ac.cn

致謝：本研究過(guò)程中得到了實(shí)驗(yàn)室李娟博士和張琳琳同學(xué)在實(shí)驗(yàn)技術(shù)等方面的諸多幫助, 在此深表感謝！

梁德海)