熱帶產卡拉膠海藻形態及表皮特征比較

龐 通, 劉建國

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院研究生院, 北京 100049)

熱帶產卡拉膠海藻形態及表皮特征比較

龐 通1,2, 劉建國1

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院研究生院, 北京 100049)

2008年6月至2009年6月, 在山東青島實驗室和海南陵水試驗平臺, 以光學顯微鏡及電子掃描顯微鏡等技術, 對12種原產印度尼西亞和菲律賓熱帶產膠紅藻外觀形態, 表皮細胞特征進行了比較。結果表明：1)不同株系藻體呈現褐色、綠色、黃綠色、翡翠綠色、橄欖綠色和咖啡色等多樣性; 2)在表皮細胞特性方面, 5號株系細胞最小、排列最致密、分布最均勻, 8號株系細胞最大、胞間距最寬; 3)在亞顯微結構方面, 1號藻呈均一球狀突起, 2和4號藻為不規則突起, 3、6和9號藻表面布滿酒窩樣凹陷, 5和8號藻表面比較平整, 7和11號藻呈腦紋狀褶皺, 12號藻在凹凸結構外覆蓋鱗片狀白色膠質; 4)在實驗株中, 1、2和4號藻未發現四分孢子, 3、5、6、11和12號藻表皮細胞上具有結構對稱的四分孢子, 且主要分布于較老的主干上; 5)在四分孢子排列上, 3、5、11和12號四分孢子間排列緊密, 6號藻四分孢子間距離較遠; 6)不同藻的四分孢子囊大小形態存在明顯差異, 6號藻株四分孢子囊最長, 約110 μm, 5號藻四分孢子囊最短, 約40 μm, 3、11、12號藻四分孢子囊長約60 μm, 四分孢子囊寬度相對恒定, 除5號藻較窄約為10 μm外, 其他株系均約為15 μm。

卡拉膠; 紅藻; 表皮細胞; 顯微結構; 四分孢子

卡拉膠在食品、化工等領域有非常廣泛的應用前景, 熱帶產卡拉膠紅藻是國際上生產卡拉膠的重要生物資源, 然而這類海藻外部形態復雜、變化多樣,分類非常困難。同時, 受到原產地材料、實驗手段、區域和技術力量等限制, 以往國內外對此關注很少,研究明顯落后。另外, 這類海藻細胞間質存在大量黏性多糖, 造成 DNA提取較為困難, 分子生物學背景研究較少[1-2]。某些種名甚至屬名隨著研究深入也出現了很大變化, 如以前稱為麒麟菜類的產膠紅藻Euchuma alvareziiDoty,striatumSchmitzh和cottoniiWeber-van Bose, 分別更改為Kappaphycus alvarezii(Doty) Doty, striatum(Schimitz) Doty和cottonii(Weber-van Bosse) Doty, 即根據產膠類型不同重新劃分為麒麟菜屬和卡帕藻屬, 產ι膠型的海菜歸屬于麒麟菜屬, 而產κ膠型的部分藻重新劃為卡帕藻屬[3-5]。

為全面了解這類海藻的基礎生物學特性, 提供科學分類依據, 同時進一步為產膠海藻栽培和相關產業發展提供基礎支撐。我們陸續收集到國內外栽培產膠紅藻株系同時采集自然海區的野生藻株, 建立起熱帶產膠生物種質資源庫, 從形態結構、細胞、植物生理生態、生化組成、抗病和抗脅迫能力、分子生物學、繁殖和發育生物學、產膠種類和含量以及凝膠強度等多層次開展相關研究。本文報道國內外目前主要栽培株系的形態和表皮細胞特性比較結果。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗材料為目前熱帶地區栽培的主要產卡拉膠海藻, 共12個株系, 分別于1984年和2008年由中國科學院海洋研究所引進, 菲律賓海菜(12號藻株)由吳超元、夏恩湛教授引自三寶顏海區, 而印度尼西亞海菜株系1至11號藻株由劉建國教授和王晉源經理引自爪哇島、瑪杜拉島和巴厘島。實驗材料經過適當的保濕和冰袋降溫處理, 空運到海南或青島后,經過一段時間海區適應性掛養, 恢復生長活性, 同時取樣照相, 其中10號株系在恢復生長過程中死亡。

1.2 表皮細胞形態觀察及電鏡制作

為減少材料不同而造成實驗誤差, 統一取健康的離藻枝頂端5 cm處的活體制作簡易表皮切片, 在光學顯微鏡下觀察表皮細胞特征, 并在 400倍放大條件下照相記錄。

同樣, 取離枝條頂端5 cm處的藻體塊1cm, 用5%戊二醛固定2 h。然后利用乙醇梯度脫水, 脫水程序依次按照30%, 50%, 70%, 80%, 90%和100%的乙醇濃度梯度進行, 每個乙醇梯度脫水15 min。樣品脫水后, 放入醋酸異戊酯置換 0.5 h, 再進行臨界點干燥和離子鍍膜機噴金處理, 最后上機(掃描電鏡KYKY-2800B)觀察照相。

1.3 四分孢子數量及形態統計

2008年6月至2009年7月, 每月定期制作表皮切片, 檢查各株系是否有四分孢子, 并于 2008年 7月每個藻株各取3個樣本材料(受材料數量限制, 7、8和 9號藻株未進行實驗), 先按照每個藻株不同級別的部位(一級主干、二級側枝和三級枝梢)逐一分開,其中每個級別部位又選取 20個不同點取表皮, 在400倍顯微鏡條件下隨機觀察統計20個視野內的孢子數量。然后在已經觀察到四分孢子的個體部位, 進行橫切制片, 觀察并記錄成熟的四分孢子囊形態和大小。

2 結果

2.1 外觀色澤、形態和表皮

實驗材料在色澤和外部形態方面呈現多樣性,有褐色、綠色、黃綠色、翡翠綠色、橄欖綠色和咖啡色等, 不同株系間存在很大差異(圖1), 其中： 1號海菜藻體橄欖綠色, 2、3和9號海菜藻體翡翠綠色, 4、5、7、8和 12號海菜藻體為黃褐色, 而 6號海菜呈現黃綠色, 11號海菜藻體為咖啡色。根據實地養殖觀察結果發現, 從菲律賓引種的12號海藻的某些藻體上可以出現綠色芽并不斷生長成綠色枝條, 通過營養繁殖將綠色藻體單獨栽培, 藻體一直保持綠色,不再返回到褐色或出現雜色, 表明綠色藻體具有遺傳穩定性。

熱帶產膠海藻形態變化多樣, 不同藻株的側芽、分支長短粗細情況也存在一定差異(圖1), 其中： 1、3和 5號海藻的側芽均較短, 且在較短處又再次出現側芽, 進一步發育成分枝, 2、4、6、7、8、9、11和12號藻株側芽主要生長于主干, 在側芽再出新芽發育成分枝的概率明顯偏少, 2、7、8、9和12號側芽比較尖細, 4、6、和 11號藻株的側芽相對要粗壯很多; 5號海菜主干周圍具有刺狀突起, 6號和11號藻株主干表皮布滿疣狀突起, 其他株系主干相對光滑。

2.2 細胞顯微結構

各株系海藻在細胞大小、分布和細胞間隙特征上存在多樣性(圖2), 1、3和5號藻株細胞及細胞間距明顯較小, 其中 5號海藻表皮細胞致密、個體最小、分布均勻; 相對而言, 2、4、9和11號海藻表皮細胞的大小、分布均一程度、以及胞間距均居中間水平; 而6、7、8和12號藻株表皮細胞比較大、細胞胞間距寬, 該特性8號藻體最突出, 其次為6和12號。

2.3 表皮細胞亞顯微結構

在表皮細胞亞顯微結構上, 不同海藻株系的電子顯微鏡掃描圖片存在很大差別(圖3)。其中： 1號藻株的藻體表面有比較均一的球狀突起, 突起直徑在4μm左右, 這是該藻明顯區別于其他藻的亞顯微特征;2和4號藻株表面結構類似, 均有不規則突起和凹陷,但是2號藻體表面形成的凹陷淺而長, 而4號藻體表面形成的凹陷深而短; 3、6和9號藻株表面情況相近,布滿酒窩樣凹陷, 3號藻表面凹陷規則, 直徑約 1～2μm, 6號表面凹陷不規則, 直徑約1～4 μm, 9號表面凹陷規則, 大小明顯比3號藻大, 約為3～4 μm; 相對于3和9號藻株, 6號藻表面相對平整, 在凹陷數量上要明顯少; 5和8號海菜表面相近, 沒有明顯凹凸結構, 表面比較平整。7和11號海藻表面狀況相近,均有腦紋狀褶皺, 其中7號褶皺突起的寬度約為3～4μm , 11號相對較窄為2～3 μm。12號藻表面可以看到明顯的凹凸結構, 同時其表面布滿很多白色膠質,呈鱗片狀覆蓋在外面。

2.4 四分孢子形態與數量

四分孢子是熱帶產膠紅藻表皮細胞特化后形成的無性生殖器官, 也是區分該類藻生活周期不同植物體的重要依據。在全年觀察的8個藻株中, 5株存在四分孢子, 表明這些株系為四分孢子體; 而 1、2和 4號藻體上沒有發現存在四分孢子。在發現存在四分孢子的5個藻株即3、5、6、11及12號藻株上,四分孢子數量(圖4)及分部部位也存在較大的差異。從統計結果來看四分孢子主要存在于主干部位, 尾梢部位除11號和12號藻分布相對稍多外, 其他均沒有發現四分孢子。

圖1 不同藻株色澤和外部形態比較Fig. 1 Comparison of colors and external forms of different strains

圖2 不同藻株表皮細胞的光學顯微鏡圖像(400倍放大)Fig. 2 Epidermal cells of different strains under optical microscope (400 times magnification)

圖3 不同藻株表皮細胞的掃描電子顯微鏡圖像(1000倍放大)Fig. 3 Epidermal cells of different strains under SEM (1000 times magnification)

圖4 四分孢子在不同藻株上的分布及數量比較Fig. 4 Comparison of distributions and numbers of tetrospores on different strains

另外, 這類熱帶產卡拉膠的紅藻同溫帶盛產瓊膠的江蘺類紅藻相比, 四分孢子數量明顯少很多。通常江蘺藻體上很容易觀察到四分孢子, 但在熱帶產卡拉膠的紅藻藻體上卻很難觀察到, 只有通過長期不斷實驗, 在大量實驗材料切片和視野觀察基礎上,才能發現零星存在。我們的檢測結果還顯示, 5個觀察到具有四分孢子的株系只有在4月份到11月份才可以觀察到有四分孢子存在, 說明了四分孢子的形成與成熟季節性的存在。

比較四分孢子和孢子囊形態大小可以發現不同藻株間存在明顯不同(圖5)。在四分孢子排列上, 3、5、6和12號藻株的四分孢子之間距離很小, 排列緊密,11號藻株比較特殊, 四分孢子之間距離較遠,排列比較疏松; 在形態方面, 所有株系四分孢子囊靠近表皮和最內部的四分孢子沿表皮切線方向的直徑均要小于中間兩個四分孢子, 然而隨四分孢子的成熟, 該差距會有所減小; 在四分孢子囊大小方面,3、11和12號藻株成熟的四分孢子囊長度約60 μm,寬度約15 μm, 5號藻四分孢子囊較小, 長度約40 μm而寬度約10 μm, 6號藻株的四分孢子囊最長, 長度約 110 μm, 寬度約 15 μm。

圖5 幾株熱帶產膠紅藻含四分孢子部分的橫切面Fig. 5 Transverse sections, showing tetrosporangium, from several tropical carrageenophyte species

表1 不同株系藻體色澤、外觀形態、表皮細胞特性比較Tab. 1 Comparison of colors, external forms and character of epidermal cells of different strains

在上述觀察結果基礎上, 我們將每個藻株特點逐一進行歸納如表1, 以便于對原產印度尼西亞和菲律賓的十幾株熱帶產膠紅藻的外觀形態, 表皮細胞特征比較, 也有利于為分類研究和育種等直接提供簡明的基礎信息。

3 討論

熱帶產膠海藻形態存在的多樣性變化一直困擾著科學分類, 因此豐富基礎問題研究和增加觀察指標, 對準確地科學分類是十分必要的。從其藻體的表皮特征指標分析, 5號藻株無論外部形態、表皮細胞的顯微和亞顯微結構, 以及四分孢子特征都與其他藻株差異較大, 表明其分類地位與其他藻株相差最遠。同樣, 1或3號藻體的形態特征與其他藻株也有很大差異, 屬于分類上相對較遠的類別, 介于5號藻株與其他藻株之間。在其余的藻株中, 6和11號藻株相似程度最大, 分類地位比較接近; 2、4、7、8、9、12號藻株相似程度較大, 親源關系也屬于比較接近的一類, 應當介于6號(或11號)藻株與1號(或3號)藻株之間。最近, 通過分析編碼小亞基核糖體蛋白的18S rDNA序列、編碼1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶／氧化酶大亞基 rbcL基因方面獲得的證據(黃曉航私人交流, 2008), 表明 1、2、4、6、7、8、9、10、11 和12號株系為K. alvarezii, 3號株系為K.cottonii, 5號株系為E. denticulatum, 該實驗基本支持根據形態對比作出的推論。

比較不同海藻外部形態可以發現, 12號藻株分枝相對較長, 藻體側芽相對更尖細。導致該現象的原因, 可能與長期生產過程中菜農的定向選擇有一定關系。該藻原產菲律賓海區, 屬于最早人工栽培的海藻株系。在30多年栽培過程中, 一般在該海菜生長速度相近的情況下, 菜農偏向選擇這類海菜作為苗源繼續栽培。這主要是由于枝條細的海菜更容易在沙灘上曬干, 在海菜價格沒有差距的情況下, 通過營養繁殖定向保留了這類特征的株系經濟效益更客觀。但是應當指出, 枝條較細的海菜, 在海灘曬干過程中更容易混雜沙土, 非常不利于隨后的工業化加工, 同時嫩枝條含膠量相對較低、凝膠強度不高[6],這是這類海菜的主要不足。另外, 菲律賓、印度尼西亞、馬來西亞和我國海南地區是國際上主要生產熱帶產膠紅藻的海域。2008年夏季, 在該地區大規模爆發的冰樣白化病害主要發生在12號海藻上, 導致很多地區的該海藻全部死亡, 表明12號藻株抗病力最弱。具有類似特征的7、8、9和10號藻株, 在該期間也發生冰樣白化病害, 但受害程度明顯較輕[7]。

眾所周知, 高等植物樹冠枝條存在頂端優勢生長, 頂芽產生并釋放植物激素, 向下運輸影響側芽生長。在熱帶產膠海菜方面, 目前尚沒有發現這類研究。為什么有些株系的藻體(如9、10和12號等)頂牙后面枝芽很少, 另外一些藻體(如 1、3號株系)在頂芽下面較早產生側芽？通過同其他類海藻、孢子植物或高等植物進行比較, 對于深入研究了解其本身生理機制, 探討基礎生命規律和生命起源演化等問題將是非常有意義的。

大型藻類屬于孢子植物, 自然條件下孢子繁殖是其保持個體繁衍的重要方式。通常大型海藻能產生并釋放數量很多的孢子, 維持種群數量。然而相對而言, 熱帶產膠紅藻產生孢子的數量較少, 在很多季節甚至很難找到四分孢子的存在, 明顯沒有溫帶產瓊膠的江蘺類紅藻多。可以認為熱帶產膠海藻孢子繁殖過程明顯退化。產生該現象我們推測有三種原因, 第一： 栽培過程中不斷營養繁殖, 苗種一般為生長較快的幼嫩枝條, 四分孢子來不及成熟, 這點從上面四分孢子主要存在于主干部位實驗數據(圖4)可以得到部分證實。第二： 這類海藻生活的熱帶海洋海底環境(如溫度、光照和鹽度等)相對恒定, 刺激藻體進行孢子形成的環境變化刺激信號相對較弱。第三： 自然選擇的結果, 該類海藻營養繁殖能力比較強大, 同時枝條相對較脆易折斷, 個體在受海流、風浪或海洋動物等外力影響發生枝條斷裂, 小枝條沉落到珊瑚礁海床, 很容易成功完成個體增殖, 而盲目地釋放孢子, 再經過單細胞不斷分裂、生長發育成為新個體, 不僅在孢子形成及釋放過程中耗費藻體自身資源, 造成藻體損傷, 而且成活率也很低[8-9]。

我們在人工栽培過程中發現, 如果將 2個不同的個體捆綁在一起, 經過一個約 30天的栽培周期, 個體之間常常發生膠聯成為一個整體。從這點分析, 該藻在自然界是比較容易固著在海床附著基上, 也部分支持上面提到的第 3個假設, 即依靠枝條斷裂營養繁殖更直接。另外, 如果通過這種方式將二個植物體整合到一起, 進一步分析其物質和信息是否發生交流, 以及如何交流的也將是十分有意義的研究方向。

盡管熱帶產膠海藻孢子繁殖過程出現退化, 在自然界很難找到像其他海藻那樣大片大片的幼苗。但是, 通過人工生物技術采集孢子, 經過適當的處理和培養, 確實可以培養成為新的幼苗[8-9]。目前我們在海南陵水熱帶海藻繁育與栽培實驗基地平臺,在不同藻株上采集和處理四分孢子都多批次成功地獲得幼苗, 經過半年培養幼苗長度可以達到6 cm左右, 同時發現植物生長激素對孢子萌發和生長發育產生重要影響, 秋水仙素誘導多倍體對藻體生長速率也產生明顯作用, 這些探索可為人工定向培育新品種提供基礎工作支撐。

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Comparison of morphological and epidermal characters of different tropical carrageenophyte species

PANG Tong1,2, LIU Jian-guo1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, 266071 Qingdao, China; 2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Feb., 12, 2010

carrageenan; red alga; epidermal cell; microscopic structure; tetraspore

The external forms and characters of epidermal cells in 12 strains of tropical eucheumatoid species were surveyed by means of optical microscope and electronic scanning microscope in Qingdao laboratory and Lingshui experimental platform during the period of June 2008 to June 2009. The results showed： 1) Different strains showed diverse colors ranging from green, yellow-green, emerald green, olive green, to brown and dark brown. 2) Among all the tested stains, strain 5 had the smallest epidermal cell size, most uniform cell distribution and narrowest intercellular space; on the contrary, strain 8 has the largest cell size, and widest intercellular space. 3) As for submicroscopic structures, uniform globular protuberances in strain 1, irregular protuberances in strain 2 and 4, dimple-like depressions in strain 2, 6 and 9, brain-like folds in strain 7 and 11, relatively smooth surface in strain 5 and 8, and rugged structure covered by white colloidal substances in stain 12 were displayed. 4) Among all the experimental strains, tetraspores were found mainly on the old branches of strain 3, 5, 6 11 and 12, however, no tetraspores was found in strain 1, 2, and 4. 5) All the tetraspores in each strain were symmetrical. The tetraspores in strain 3, 5, 11 and 12 connected closely in contrast to loosen array in strain 6. 6) The size of tetrasporangium in different strains varied significantly. Strian 6 and strain 5 had the longest and shortest tetrasporangium, respectively,which are about 110 μm and 40 μm, different from the tetrasporangiums of strain 3, 11 and 12, which were all about 60 μm. Tetrasporangiums of most strains had a fixed 15 μm width except strain 5, which was about 10 μm.

S917.3

A

1000-3096(2011)06-0013-06

2010-02-12;

2010-04-01

國家自然科學基金項目(30771639); 國家海洋公益項目(200705010, 2012418039)

龐通(1985-), 男, 山東聊城人, 博士研究生, 主要從事海洋生物研究, 電話： 0532-82898562, E-mail： pangtongone@163.com,劉建國, 通信作者, 研究員, 電話： 0532-82898709, E-mail： jgliu@qdio.ac.cn

張培新)