生物活性肽-蛋氨酸腦啡肽對成骨細胞增殖的影響

薛明，高陽，楊諦，仇麗鴻

(1.中國醫科大學口腔醫學院牙體牙髓科遼寧省口腔醫學研究所牙體牙髓病研究室，遼寧沈陽110002;2.沈陽市鐵西區中心醫院口腔科，遼寧沈陽110021)

骨組織吸收是根尖周病變和牙周病變中一個重要的病理改變，其治療的最終目的是誘導成骨細胞增殖，分泌基質從而礦化為骨組織，使缺失的牙槽骨重建［1］。成骨細胞的增殖受多種因素相互作用的影響，包括激素、細胞因子和局部生長因子等，這些因素的存在能夠影響骨組織形成和礦化［2］。本實驗研究蛋氨酸腦啡肽(Methionine Enkephalin，MENK)對成骨細胞增殖的影響，探討影響成骨細胞增殖的病理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

MC3T3-E1，中國科學院細胞庫;DMEM培養基，Gibco(美國);10%胎牛血清，天津灝洋生物制品;胰蛋白酶，Amresco(美國);MENK，純度:＞97%，美國Penta生物技術公司出品，批號:TH10002。

1.2 方法

1.2.1 MC3T3-E1細胞的培養從液氮中取出凍存的MC3T3-E1細胞，迅速放入37℃溫水中，輕輕搖動凍存管令其內容物盡快融化。用吸管吸出細胞懸液至離心管，加入新鮮培養基10 mL，輕吹懸浮細胞，1 000 r/min離心5 min，去上清，再用培養液重復洗1次。將MC3T3-E1細胞以5×105個/mL密度接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置于含5%CO2、37℃、飽和濕度的CO2培養箱中培養，24 h后換液1次。當細胞生長狀態良好，至覆蓋培養瓶底80%時，以0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代。

1.2.2 細胞增殖的測定取生長狀態良好、幾乎長滿瓶底的MC3T3-E1細胞進行傳代，制備成濃度為1×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔培養板，分為1個對照組和10個實驗組，每組設3個復孔，每孔100 μL。37℃、5 ml/L CO2培養箱培養24 h。實驗組分別加入100 μL終濃度分別為10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9、10－10mol/L的MENK，對照組加入等體積的DMEM培養基，繼續培養48 h。各孔加入MTT 10 μL，繼續培養4 h。吸出培養液，每孔各加入二甲基亞砜100 μL，作用10 min后，酶聯免疫檢測儀測定各孔的吸光度值(A570nm)。

1.2.3 統計學處理應用SPSS11.0軟件包對實驗數據進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析，實驗組與對照組比較采用Dunnett-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

MENK對成骨細胞的增殖有促進作用，與對照組比較，10－7、10－8、10－9mol/L的MENK的促增殖作用有統計學意義(P＜0.05)(表1、圖1)。

表1 各組成骨細胞的平均吸光度值(A570nm)Table 1 The mean absorbency values of osteoblasts(A570nm)

續表

圖1 不同濃度組的MENK對成骨細胞增殖的影響Fig.1 The effect of MENK on the proliferation of osteoblasts

3 討論

阿片類藥物早已被人們所熟知，其既有強大的鎮痛作用，又有明顯的欣快感覺及成癮作用，隨著研究的深入，發現體內存在著與阿片受體相結合的內源性阿片樣物質，MENK是其中之一，由腎上腺產生的前激素和前腦啡肽衍生而來。MENK是由5個氨基酸組成的五肽，在神經系統、免疫系統、腫瘤組織和正常組織中均有分布，被稱為新型的細胞因子［3］。關于MENK的研究，目前主要集中在以下方面［4］:抗腫瘤作用、鎮痛作用、抗微生物感染作用、免疫功能增強作用、治療艾滋病的作用等。另外，MENK還具有非阿片樣作用，如調節細胞生長等［5］。

研究表明MENK在不同情況下，對不同細胞可以產生不同的生物效應，但MENK的作用機理并不十分清楚，MENK可以通過多種途徑將信號傳遞到細胞內而發揮作用。在不同情況下，如不同的使用劑量有可能導致MENK結合不同的受體，信號傳遞主要途徑就可能發生變化，也就產生了不同的生物效應［4］。Elhassan等［6］研究表明，MENK在不同的骨組織中分布不同。在表達Ⅰ型膠原蛋白的成熟骨基質中，MENK分布較多，而在成骨細胞中，分布相對較低。在骨和軟骨發育過程中，腦啡肽原的活性較高［7］。在成骨細胞表面，發現了3種內源性腦啡肽的受體［8］。這些研究提示，MENK在骨形成過程中起到一定作用。在本實驗中，將不同濃度的MENK作用于成骨細胞，來觀察其對成骨細胞的作用，結果表明，10－7、10－8、10－9mol/L的MENK對成骨細胞的增殖具有促進作用。正常人血漿中MENK的濃度為10－11mol/L［4］，而本實驗中的有效作用濃度均高于生理濃度，提示MENK可作為藥物，在骨缺損疾病中發揮促進骨組織重建的作用。

MENK生產簡單，分子量小，毒副作用少，并且伴隨著神經化學和分子生物學技術的發展，特別是阿片受體的基因剔除、計算機的模擬結構分析等技術的應用，MENK將會更多的被應用于臨床治療領域。本實驗中10－7、10－8、10－9mol/L的MENK能夠促進成骨細胞增殖，為以骨缺損為主要病理表現之一的慢性根尖周病的藥物治療提供了一個新的思考方向。

［1］ 趙秀敏，艾紅軍，常新.成骨細胞和破骨細胞的傳導通路和相關因子［J］.中國實用口腔科雜志，2009，2(3):176-179.

［2］ Kessler S，Katler S，Mayr-Wohfart U，et al.Stimulation of primary cultures with rh-TGF-beta，rh-bFGF，rh-BMP2 and rx-BMP4 in an in vitro model［J］.Orthopade，2000，29(2):107-111.

［3］ KOWALSKI J，MAKOWIECKA K，BELOWSKI D，et al.Augmenting effect of methionine-enkephalin on interleukin-6 production by cytokine-stimulated ro utine macrophages［J］.Neuropeptides，2000，34(3/4):187-192.

［4］ 張領兵.蛋氨酸腦啡肽研究進展及其應用前景［J］.國外醫學免疫學分冊，2005，28(6):345-348.

［5］ Wollemann M，Benyhe S.Non-opioid actions of opioid peptides［J］.Life-Sci，2004，75(3):257-270.

［6］ Methionine-enkephalin in bone and joint tissues［J］.J Bone Miner Res，1998，13(1):88-95.

［7］ Rosen H，Krichevsky A，Polakiewicz RD，et al.Developmental regulation of proenkephalin gene expression in osteoblasts［J］.Mol Endocrinol，1995，9(11):1621-1631.

［8］ Perez-Castrillon JL，Olmos JM，Gomez JJ，et al.Expression of opioid receptors in osteoblast-like MG-63 cells，and effects of different opioid agonists on alkaline phosphatase and osteocalcin secretion by these cells［J］.Neuroendocrinology，2000，72(3):187-194.