高壓氧對正常及SIRS大鼠脾T淋巴細胞的影響

王佐周，趙寶寶，王鋼*

(1.中國醫科大學基礎醫學院病理教研室，遼寧沈陽110001;2.中國醫科大學附屬第一醫院急診科，遼寧沈陽110001)

高壓氧作為一種治療手段，廣泛應用于臨床。研究顯示高壓氧促進傷口部位的纖維母細胞、上皮細胞和血管的增生，促進傷口愈合，增強細胞的殺菌能力，對特殊厭氧菌具有致命的殺傷力［1］。另外，高壓氧還表現出廣泛的細胞分子學反應，包括細胞內信號轉導和基因功能調節，高壓氧的生化作用包括調節粘附分子，抗氧化酶，生長因子和細胞因子的表達，調節一氧化氮的釋放，微循環的灌注和細胞能量的干預等［2］。然而，高壓氧在免疫調節和抗炎作用方面的研究以及在全身炎癥反應綜合征中的應用尚不多見。高壓氧暴露之后機體抗氧化能力增強，這種抗氧化反應強度同氧化應激程度相關。在全身炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)狀態下，高壓氧的免疫調節作用，包括對T細胞的影響以及抗炎作用的研究尚不多見。SIRS從一個新的角度闡明多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要病理生理及發生發展過程。經過10余年的大量實驗研究和臨床資料揭示，創傷、感染、休克發展到MODS存在著一條共同通路，即SIRS［3］。本實驗以SIRS為基礎，以免疫功能和炎癥反應中具有代表性的脾T淋巴細胞為研究對象，研究高壓氧對正常機體以及SIRS時細胞免疫功能的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組健康雄性SD大鼠50只，購自中國醫科大學實驗動物中心，體重約140～180 g，隨機分為5組，每組10只。A組:腹腔注射等量生理鹽水;B組:腹腔注射等量生理鹽水，做3次高壓氧;C組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500 mg/kg);D組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500 mg/kg)，做1次高壓氧;E組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500 mg/kg)，做3次高壓氧。

1.1.2 主要試劑和儀器酵母多糖-A(Sigma公司);抗大鼠FITC-CD3，PE-CD4，PE-CD8(biolegend公司);流式細胞儀;動物高壓氧艙(DWC400A/0.2-1，華信，濰坊)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SIRS模型建立將酵母多糖粉劑和無菌液體石蠟混合，高頻振蕩15 min，100℃水浴80 min滅菌，制成濃度為100 mg/mL的酵母多糖A-石蠟混懸液，存放于4℃備用，臨用前40℃水浴復溫，高頻振蕩15 min后注藥。大鼠實驗前18 h開始禁食，不禁水。C、D、E組以500 mg/kg體重給大鼠腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液，A、B組注射等量生理鹽水。

1.2.2 高壓氧治療方案做1次高壓氧的時間為腹腔注射后4 h，做3次高壓氧的時間分別為腹腔注射后4、10、18 h。每次高壓氧都遵循以下方案:100%純氧洗艙5 min，以清除艙內原有空氣。勻速加壓至2ATA(約10～15 min)，用已校對的測氧儀測艙內氧濃度達95%以上，期間以4 L/min的速度持續通O2避免CO2蓄積，并將壓力維持在2ATA。1 h后以同樣速度勻速減至常壓，出艙。

1.2.3 標本采集及檢測腹腔注射24 h后，每只鼠按實驗設定順序取脾，標號，脾臟剪至糊狀，100目篩濾過(加PBS)，離心1 000 r/min 10 min，棄上清，低滲休克法溶解紅細胞，RPMI 1640調整細胞濃度1×106/mL。取上述液體0.1 mL，4℃離心10 min，棄上清，加入冷PBS 1 mL，輕輕震蕩，1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，重復2次。加200 μL Buffer，加10 μL AnnexinV-FITC，加PI 10 μL，25℃，15 min。加300 μL Buffer 30 min內上流式細胞儀測量。

1.2.4 統計學方法用SPSS 13.0軟件分析數據。各組數值用均數±標準差表示，用F檢驗做方差齊性檢驗，當方差齊性相等時，2組間采用兩獨立樣本t檢驗，方差齊性不等時采用近似t檢驗即t'檢驗。設P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 大鼠SIRS模型建立效果

一般情況:腹腔注射酵母多糖-石蠟溶液組大鼠呼吸急促，伴有明顯喘鳴，皮膚黏膜發紺、出汗、毛色灰暗，部分大鼠有鼻出血、腹脹、腹瀉。大鼠進食明顯減少，活動差，對外界刺激無反抗。大體改變:殺鼠后，見SIRS組大鼠腹腔滲出增多，腸管擴張，程度不一;肝臟呈暗紅色或暗紫色;肺臟可見不同程度腫脹，部分可見充血出血點;心臟、腎臟、脾臟、胰腺無明顯大體改變。

2.2 酵母多糖對脾T細胞的影響

注射酵母多糖的大鼠CD4+和CD8+T細胞均較對照組明顯減少(P＜0.01)，減少程度基本平行，所以CD3+CD4+/CD3+CD8+無變化(表1、圖1)。

2.3 高壓氧對正常大鼠脾T細胞的影響

B組CD4+T細胞比例同對照組(A組)相比明顯減少(P＜0.01)，CD8+T細胞基本無變化，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值明顯下降(P＜0.05)(表1、圖1)。

2.4 高壓氧對SIRS大鼠脾T細胞的影響

高壓氧使酵母多糖導致的CD4+T細胞減少明顯恢復(P＜0.05)。同高壓氧對正常大鼠T細胞的影響一樣，高壓氧幾乎不影響CD8+T細胞，故CD3+CD4+/CD3+CD8+比值升高(P＜0.05)(表1、圖1)。

2.51 次高壓氧和3次高壓氧對脾T細胞的不同影響

表1 各組CD4+、CD8+T細胞比例以及二者比值(%±s，n=10)Table 1 The percentage of CD4+、CD8+T lymphocytes and the ratio of CD4+/CD8+(%，ˉχ±s，n=10)

表1 各組CD4+、CD8+T細胞比例以及二者比值(%±s，n=10)Table 1 The percentage of CD4+、CD8+T lymphocytes and the ratio of CD4+/CD8+(%，ˉχ±s，n=10)

注:#同A組比較P＜0.05，##同A組比較P＜0.01，*同C組比較P＜0.05

組別CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD4+/CD3+CD8+A組85.53±7.1916.98±3.0414.08±3.411.38±0.28 B組81.33±9.7618.09±1.93##13.44±4.401.01±0.20##C組74.56±4.3013.59±2.67##9.75±3.19##1.37±0.41 D組81.51±5.2219.68±5.17*9.67±2.891.69±0.10*E組87.15±8.4018.48±3.829.73±2.411.78±0.33*

D組和E組的CD4+和CD8+T細胞比例無統計學差異(表1、圖1)。也就是說，3次高壓氧治療對于CD4+T細胞的恢復并不比1次高壓氧治療具有更好的效果。

圖1 各組CD3+CD4+、CD3+CD8+比例以及CD3+CD4+/CD3+CD8+比值的變化Fig.1 The percentage of CD3+CD4+、CD3+CD8+T lymphocytes and the ratio of CD3+CD4+/CD3+CD8+

3 討論

現有研究表明酵母多糖致大鼠SIRS嚴重程度具有劑量依賴性［4］，本實驗依據參考文獻［5］選取500 mg/kg體重進行酵母多糖腹腔注射，所有大鼠均出現CD4+、CD8+T細胞的減少。Bone將典型的SIRS分成5個時期:第1期為局部炎癥反應期;第2期為全身炎癥反應始動期;第3期為全身炎癥反應期，機體出現失去控制的、自我持續放大和自我破壞的炎癥;第4期為CARS期(代償性抗炎反應綜合征，compensatory anti－inflammatory response syndrome)，抗炎反應過度，導致免疫功能抑制及對感染的控制和抵抗能力下降;第5期為免疫不協調期，表現為多臟器功能失調，臨床死亡率高［6］。實驗結果所示CD4+、CD8+T細胞明顯減少，提示機體此時已經處于免疫功能低下狀態，這種免疫細胞的受累是否是促進SIRS向多臟器功能衰竭進展的原因之一，恢復免疫細胞數量和功能是否可以避免SIRS的進一步發生發展有待進一步實驗證實。

本實驗中，高壓氧對正常大鼠和SIRS大鼠表現出的截然不同的作用。已有研究表明高壓氧具有類似“雙刃劍”的作用，一方面，在機體處于高炎癥狀態時，高壓氧可以減少炎癥介質的合成和釋放，從而減輕機體的炎癥反應。另一方面，高壓氧對內源性免疫和適應性免疫產生廣泛抑制。包括減少抗原合成，抑制B細胞的產生抗體;損傷Th1型細胞介導的促炎型免疫反應;高壓氧可以非特異性刺激T細胞產生大量IL-10，以產生強大的免疫抑制作用［7-8］。造成高壓氧這種“雙刃劍”做用的原因可能包括:a)壓力。2.5ATA時膿毒癥大鼠病死率降低，3ATA時病死率明顯增高，說明壓力同免疫功能改變之間可能存在劑量－依賴關系，但這種劑量依賴關系只跟氧分壓有關，而不僅僅是單純的氣壓程度［9］;b)暴露時間。可以假設機體在3次暴露于高壓氧后呈現免疫抑制狀態之前，經歷了免疫功能由促進到抑制的過程，起先抗氧化反應增強以對抗氧化應激反應，但隨著氧化應激程度加重和時間延長，抗氧化系統進一步亢進使機體呈現免疫抑制狀態。所以即使常規治療劑量的高壓氧對正常的免疫細胞也可能是過量的。雖然壓力和暴露時間可能參與了高壓氧的這種“雙刃劍”作用，但并不是這種復雜調節作用的唯一決定因素，本實驗中，高壓氧對正常大鼠及SIRS大鼠CD4+T細胞產生完全相反的調節作用，說明高壓氧這種雙向調節作用可以不依賴壓力和暴露時間。

高壓氧可通過誘導細胞凋亡抑制細胞介導的免疫反應，并且凋亡隨暴露次數增多而增多［8，10］。本實驗中，高壓氧使正常大鼠CD4+T細胞明顯減少，CD8+T細胞數則沒有變化。可能高壓氧只特異性影響CD4T細胞，通過誘導凋亡的方式減少CD4+T細胞數量從而減弱其輔助功能，導致免疫功能下降;或者高壓氧對CD4+T細胞以減少其數量為主，對CD8T細胞則通過降低其細胞膜的流動性直接損傷其靶細胞殺傷能力［11］。

本實驗通過對大鼠脾T淋巴細胞的研究，證實高壓氧對于免疫功能具有雙向調節作用，在正常機體可引起免疫功能抑制，而在SIRS狀態下，可以促進機體受損的免疫功能恢復，并且這種作用可以不依賴壓力和暴露時間。

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