氦氧飽和高氣壓暴露對銅綠假單胞菌毒力表型的誘導調節

陳雙紅，陳銳勇，肖衛兵，徐雄利，武文斌，巴劍波

(中國人民解放軍海軍醫學研究所艦艇衛生研究室高氣壓與潛水生理學全軍重點實驗室，上海200433)

銅綠假單胞菌感染多見于臨床免疫缺陷、燒傷和肺囊性纖維化等人群，極少見于健康個體。而本研究組調查資料顯示健康潛水作業人員中耳炎、皮膚黏膜感染幾乎都為銅綠假單胞菌，并且飽和潛水高氣壓環境中銅綠假單胞菌的非常態化職業感染已嚴重影響作業人員健康和作業效率［1-2］。為揭示潛水高氣壓環境對銅綠假單胞菌感染的適應性調節作用，本文比較研究常規生長環境和氦氧飽和高氣壓暴露環境下銅綠假單胞菌的生長、運動能力，關鍵毒力因子的分泌水平，及其對整體動物的毒力水平，并以該研究為基礎，為以后進一步揭示銅綠假單胞菌的非常態化職業感染機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料銅綠假單胞菌為本單位從受試潛水員外耳道分離并鑒定。選擇受試前分離的銅綠假單胞菌作為對照組，4.5 MPa氦氧飽和暴露后72、144 h的細菌作為實驗組。實驗用昆明種小鼠，購自第二軍醫大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑銅綠假單胞菌培養和分離用肉湯、血瓊脂和乙酰胺培養基，上海科瑪嘉公司;生化鑒定管、半固體動力培養基，青島海博生物技術公司;剛果紅-彈性硬蛋白，Sigma公司;其他生化試劑購自國藥集團上海分公司。

1.1.3 主要儀器Bio-Rad酶標儀;721型分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌的分離鑒定和生長曲線測定銅綠假單胞菌分離鑒定參照文獻［3］標準程序進行。對照組細菌和飽和暴露實驗組細菌用L-broth液基調整初始濃度至1.0×104cfu/mL，37℃培養，每隔2～3 h測OD620值，每組樣本設置3支平行管。同時將稀釋濃度為1.0×103cfu/mL的細菌涂布于乙酰胺平板，37℃培養10 h后觀察不同處理組細菌對乙酰胺酶的分解能力。

1.2.2 銅綠假單胞菌運動能力的檢測用L-broth液基調整對照組和實驗組細菌至初始濃度1×108cfu/mL，各取2 μL菌液點種于半固體運動檢測培養基表面，37℃靜置培養24 h后觀察結果并拍照。

1.2.3 綠膿菌素含量測定［4］用L-broth液基調整對照組、實驗組細菌濃度至1.0×105cfu/mL，各取500 μL至5 mL L-broth液基，37℃震蕩培養12 h。然后將培養混懸液分別離心留取上層培養液，加入等體積氯仿充分振蕩2 h。隨后移出有機相，加入1/5體積的1 mol/L鹽酸，混合后靜置10 min，取上層鹽酸相測OD520值，每個樣本設置3個平行管。同時各組細菌以1.0×103cfu/mL濃度平鋪于綠膿菌素顯色培養板，37℃培養直觀觀察綠膿菌素變化并拍照。

1.2.4 彈性蛋白酶活性測定［5］細菌的處理和培養同1.2.3，培養液離心取上清，每1 mL上清液中加入20 mg剛果紅-彈性硬蛋白、1 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.2;0.5 mmol/L CaCl2)。該混合物37℃振蕩反應6 h，加入0.1 mL 0.12 mol/L的EDTA置于冰上終止反應。離心除去未溶解的剛果紅-彈性硬蛋白，上清液于酶標儀495 nm處測OD值。

1.2.5 小鼠毒力實驗雌性昆明種小鼠(20±2)g 30只，隨機分3組，每組10只，對照組細菌和實驗暴露組細菌調整濃度至1×108cfu/mL，每只小鼠腹腔注射100 μL菌液。同時設置等量L-broth液基注射的空白對照小鼠組。每天記錄小鼠的存活數量，計算存活率。

1.2.6 統計學分析根據實驗結果數據分布特點和性質，選用SPSS統計分析軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 銅綠假單胞菌生長曲線測定

實驗中將對照組細菌、飽和加壓暴露后細菌以1×103cfu/mL濃度涂布于乙酰胺平板，10 h后觀察顯示實驗組細菌對乙酰胺的分解速度明顯快于對照組(圖1A)。表明暴露組細菌乙酰胺酶的分泌水平高于對照組，亦即銅綠假單胞菌通過快速分解乙酰胺提供細胞生長所需碳源。平行進行的細菌生長曲線的測定結果顯示經短暫擴增2 h后，同一檢測時相點暴露組細菌在620 nm處的OD值明顯高于對照菌(P＜0.01)。同一擴增時相點暴露144 h組細菌增殖能力高于暴露72 h組，但無顯著性差異(圖1B)。該研究結果表明，飽和暴露條件影響實驗菌的生長速度，并提高了細菌對乙酰胺酶的分泌能力，以適應細菌快速增殖對細胞外碳源的利用。2暴露組結果的比較表明，經72 h飽和暴露誘導后細菌生長特性達到對環境調節的階段性穩態適應，進一步生物學性狀誘導改變則可能需要更長時間(＞144 h)的慢性暴露。

2.2 銅綠假單胞菌運動能力測定

對照組和不同暴露組細菌點種于半固體動力培養基生長24 h后結果顯示，暴露組細菌的運動能力明顯強于對照組細菌(圖2)。研究表明，細菌運動能力增強是其在宿主體內侵襲和定植功能得以快速實現的前提。因此，暴露環境對細菌運動能力的正向誘導調節作用與氦氧飽和暴露環境人群銅綠假單胞菌職業感染高發密切相關。

2.3 細菌彈性蛋白酶活性測定

對照組和暴露組細菌細胞外液彈性蛋白酶對剛果紅-彈性硬蛋白的分解能力見圖3。結果表明，相同濃度細菌的細胞外培養液彈性蛋白酶對底物的分解能力不同，暴露組細菌細胞外液彈性蛋白酶對底物的分解能力明顯強于對照組細菌(P＜0.05)，2實驗組之間差異不明顯。因此，飽和暴露條件可能是通過提高細菌彈性蛋白酶的產量或其活性而增強其對底物(彈性硬蛋白)的分解能力，以達到對周圍組織的快速破壞，適應快速生長的營養需求。而在72～144 h的飽和暴露時程中細菌的部分生物學特性可能處在適應調節的穩態階段，故而實驗組結果差異不明顯。

2.4 銅綠假單胞菌綠膿菌素測定

對照組和飽和加壓暴露后細菌以1×103cfu/mL濃度涂布于綠膿菌素測定用培養平板，12 h后觀察顯示，實驗組細菌綠膿菌素產量明顯高于對照組(圖4A)。培養液鹽酸顯色后測520 nm處的OD值也證明這一結果(P＜0.05)，144 h暴露組綠膿菌素產量高于72 h暴露組(圖4A，B)。

圖3 氦氧飽和高氣壓暴露后銅綠假單胞菌細胞外液對彈性蛋白的活性測定Fig.3 The activity of elastic of hyperbaric oxyhelium exposure Pseudomonas aeruginosa

圖4 氦氧飽和高氣壓暴露后銅綠假單胞菌綠膿菌素的含量檢測Fig.4 The level of pyocyanin of hyperbaric oxyhelium exposure pseudomonas aeruginosa

2.5 銅綠假單胞菌對小鼠毒力的測定

整體動物水平的毒力實驗表明，飽和暴露細菌注射組小鼠半數死亡時間≤4 d，對照組細菌注射組小鼠的半數死亡時間≥11 d，L-broth液基空白對照組小鼠在整個觀察期無死亡(圖5)。實驗組與對照組毒力經Long-rank分析具有統計學意義(P＜0.01)。因此，動物染毒實驗結果進一步證明氦氧飽和高壓暴露后細菌毒力增強。

圖5 氦氧飽和暴露銅綠假單胞菌小鼠染毒存活率Fig.5 Survival ratios of mice infected with hyperbaric oxyhelium exposure pseudomonas aeruginosa

3 討論

氦氧飽和高氣壓潛水作業與普通環境差異大，常規潛水作業壓力范圍為0.6～4.6 MPa，遠遠超出普通細菌生長的0.1 MPa范圍。資料顯示，2 MPa以下的壓力對普通細菌的生長和分化就已產生明顯影響，50 MPa壓力將使耐壓菌的生長分化完全抑制。壓力作用下細菌主要通過調整細胞膜結構、膜蛋白成分、骨架結構、細胞內酶活性、關鍵基因的表達水平等以適應特殊環境下的生存壓力［2，6-7］。銅綠假單胞菌對環境有極強的適應性，環境信號刺激激活銅綠假單胞菌諸多調節系統進而有序調控目的基因和蛋白表達，是實現種內、種間交流并完成生物特異適應性的關鍵步驟。研究表明，銅綠假單胞菌接受環境信號刺激并被激活的因子主要包括與毒力調節、生物膜形成、鞭毛運動、細菌與宿主間的識別等致病相關的關鍵因子。細菌通過對這些因子功能的調節，最終實現利于種群生長、侵襲、定植、免疫逃避和耐藥性產生等有益生長表型［7-12］。

生理狀況下銅綠假單胞菌的致病性主要取決于鞭毛、菌毛的運動黏附能力、破壞宿主組織細胞的胞外產物如綠膿菌素、彈性蛋白酶的分泌，以及一些主要致病因子，如細胞外毒素、外膜蛋白的活性等，其中與細菌運動黏附、侵襲定植等相關的毒性因子在其急性感染期起重要作用［13］。由于在氦氧飽和高氣壓暴露下銅綠假單胞菌引起的多為急性感染，故本研究主要選擇與急性感染相關的毒力因子表型作為研究對象。結果顯示，暴露后傳代的銅綠假單胞菌在普通生長環境中出現快速增殖，并且通過提高單位細胞乙酰胺酶的產量快速分解培養基中乙酰胺以提供生長所需碳源;暴露后銅綠假單胞菌的運動能力明顯強于對照組細菌;彈性蛋白酶和綠膿菌素是細菌破壞宿主細胞組織實現侵襲感染的主要毒力因子，這些毒力因子在暴露后都出現分泌水平或生理活性的明顯增加。

維持種群生長密度是細菌感染適應的前提，運動黏附是細菌感染侵襲定植的基礎，實現侵襲定植是細菌感染宿主并繼續維持種群繁榮的最終目的。本研究的最終結果表明氦氧飽和高氣壓暴露環境對銅綠假單胞菌急性感染毒力因子表型有正向調節作用，這可能是該環境中銅綠假單胞菌的職業化高感染率發生的主要原因。然而，氦氧飽和高氣壓暴露通過何種途徑實現對銅綠假單胞菌毒力表型的正向調節還是一個需要進一步研究的內容，明確該調控機制將對預防和控制職業性高感染率有重要意義。

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