菠蘿渣纖維素降解菌的篩選及鑒定

羅萍，陳永輝，賀軍軍，李勤奮，劉洋，易潤華

(1.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南儋州571737;2.中國熱帶農業科學院湛江實驗站，廣東湛江524013;3.廣東海洋大學，廣東湛江524088)

菠蘿原名鳳梨，原產巴西，目前已廣泛分布在南北回歸線之間，成為世界重要的果樹之一。16世紀時傳入我國，在廣東、廣西、福建、臺灣等地區大面積栽培種植，種植面積達70 000 hm2左右［1］。然而，由于菠蘿保存期較短，收獲后常用來加工罐頭、濃縮汁和蜜餞等，占全果重50%～60%的菠蘿皮副產品多被堆積廢棄，造成環境污染和資源浪費［2-3］。近年來，隨著國內對廢棄物綜合利用的開發，菠蘿加工副產品在資源化利用越來越受到重視，其中生物肥料化利用成為生產中的有效利用方式，但對其科學研究很少［4-5］，特別是在利用有效微生物加快發酵方面未見報道。本研究從微生物加快菠蘿渣發酵熟化的角度出發，通過對不同堆放時間的菠蘿渣中的微生物進行分離、純化和篩選，選出菠蘿渣中的高效降解纖維素菌株，并對其最佳功能培養基進行了篩選及優化，以期為菠蘿渣肥料化的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離材料采集用于分離的菠蘿渣采自廣東省豐收糖業發展有限公司堆積場中。

1.1.2 供試分離和篩選培養基樣品分離采用4種培養基，具體如下:①赫奇遜CMC培養基(C1，g/L):NaCl 0.1，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.3，FeCl30.01，CaCl20.1，NaNO32.5，CMC 10，瓊脂20，pH 7.2～7.4;②赫奇遜CMC-Na培養基(C2，g/L):NaCl 0.1，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.3，FeCl30.01，CaCl20.1，NaNO32.5，CMC-Na 10，瓊脂20，pH 7.2～7.4;③纖維素剛果紅平板培養基(C3，g/L):(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41，NaCl 0.5，CMC-Na 10，瓊脂20，剛果紅0.2，pH值自然;④纖維素剛果紅平板培養基(C4，g/L):(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41，NaCl 0.5，CMC 10，瓊脂20，剛果紅0.2，pH值自然。功能菌株篩選培養基，具體如下:①Dubos纖維素培養基(g/L):NaNO30.5，K2HPO41，Fe2(SO4)3·7H2O 0.001，CMC 5，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，pH 7.5;②Hutchison培養基(g/L):NaNO32.5，NaCl 0.1，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.3，FeCl30.01，CaCl20.1，CMC 5，pH 7.2～7.4;③磷酸銨鈉培養基(g/L):Na(NH4)HPO42，CaCO35，KH2PO41，CaCl2·6H2O 0.3，MgSO4·7H2O 0.5，蛋白胨1，纖維素5 g;④蛋白胨纖維素培養基(g/L):NaCl 5，CaCO32，K2HPO40.5，MgSO40.5，剛果紅0.1，蛋白胨5，酵母膏5，纖維素5，微量元素溶液0.5 mL(微量元素溶液成分(g/L):ZnSO40.30，CaCl20.25，CuSO40.25，FeSO40.20)，50℃靜置培養;⑤改良纖維素剛果紅培養基(g/L):NaCl 0.5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41，纖維素粉5，蛋白胨1，pH值自然;⑥CMC培養基(g/L):(NH4)2SO44，KH2PO42，CMC-Na 5，MgSO4·7H2O 0.5，蛋白胨1，pH 7.0～7.4。

1.2 方法

1.2.1 纖維素降解菌的分離采用平板稀釋法進行分離。稱取菠蘿渣樣品1 g，加入無菌水10 mL，在振蕩機上振蕩10 min，形成懸液，吸取1 mL懸液依10倍法稀釋到10－6，取10－6稀釋液0.1 mL涂布于分離培養基中，每處理重復3次，28℃培養72～96 h，計算菌落數。根據菌落形態、顏色等挑取單菌落，按常規方法純化后保存。

1.2.2 纖維素功能降解菌的篩選菌株初篩采用濾紙分解法，將濾紙剪成小條，放入試管中，使其略露出液面。將各菌株接種到以濾紙為唯一碳源的Dubos液體培養基中，然后于30℃110 r/min振蕩培養5 d，觀察濾紙的崩解效果;在初篩的基礎上，以FPA酶(3，5-乙硝基水楊酸比色法測定)為評價指標進一步篩選得出纖維素功能降解菌株。

1.2.3 培養基篩選將篩選得到的功能菌株分別接種到菌株篩選培養基中，進行功能培養基的篩選，每個處理3個重復。

1.2.4 菌株鑒定對篩選出的纖維素降解菌進行種的鑒定:①形態學特征鑒定:將篩選出的纖維素降解菌接種于PDA平板中，28℃，恒溫培養2～3 d，觀察其菌落的生長情況、外觀形態;②生理生化特征:主要包括過氧化氫酶、苯丙氨酸脫氨酶、卵磷脂酶試驗，糖、醇類分解試驗，V-P測定，明膠液化，淀粉水解，丙二酸利用，吲哚產生及生長pH值和溫度的測定等，方法參考東秀珠《常見細菌系統鑒定手冊》［6］;③分子鑒定:細菌的16S分析:經改良的SDS法提取菌株降解微生物的基因組DNA。PCR引物為細菌鑒定通用引物:16(+)5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16(－)5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3'。25 μL擴增體系:模板2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，10×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，dNTPs(2 mmol/L)2.5 μL，Taq(3 U/μ)0.35 μL，ddH2O 13.15 μL。將提取的基因組DNA作為模板進行PCR擴增。反應程序:94℃4 min;94℃1 min，50℃30 s，72℃30 s，35個循環;72℃10 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳在標準條件下檢測。瓊脂糖凝膠電泳并回收目標DNA片段，由生工生物工程(上海)有限公司完成測序，測序結果用BLAST軟件在GenBank進行同源性比較，以Clustal X進行多序列比對后，用MEGA 4.0的Neighbor-Joining法構建同源進化樹，并進行1 000次Bootstraps檢驗。

2 結果與分析

2.1 功能菌株分離

由表1可知，從4種分離培養基來看，纖維素剛果紅平板培養基Ⅰ(C3)的分離效果最好，平均分離菌落數為36.4 cfu/g;赫奇遜CMC培養基(C1)、赫奇遜CMC-Na培養基(C2)和纖維素剛果紅平板培養基Ⅱ(C4)的分離效果相對較差。

表1 不同培養基纖維素降解菌株分離效果(單位:cfu/g)Table 1 Effect of cellulose degradation strains in different mediums(Unit:cfu/g)

2.2 功能菌株初篩

表2 纖維素降解功能菌株篩選Table 2 First screening of cellulose degrading-bacteria

采用濾紙分解法對纖維素降解菌進行初篩，由表2可看出，從菠蘿渣中共獲得了72個菌株，其中17個菌株降解能力強，19個菌株有中度降解能力，25個菌株有輕微降解能力，11個菌株沒有任何降解能力。

2.3 功能菌株復篩

表3 纖維素降解功能菌株復篩(單位:μg/(mL·h))Table 3 Second screening of cellulose degrading-bacteria(Unit:μg/(mL·h))

2.4 功能培養基篩選

表4 功能菌株在不同培養基上FPA酶活(單位:μg/(mL·h))Table 4 FPA enzyme activity of degrading-bacteria in different mediums(Unit:μg/(mL·h))

利用功能菌株在不同培養基上的FPA酶活性來評價菌株功能發揮的最適培養基。由表4可知，c3b1-3菌株FPA酶活性在6種不同培養基表現不一，在蛋白胨纖維素培養基上最高為48.13 μg/(mL·h)。因此，c3b1-3菌株最適功能培養基分別是蛋白胨纖維素培養基(g/L):NaCl 5，

濾紙中的纖維素含量較高，FPA酶水解濾紙中的纖維素，釋放出的還原糖與3，5-乙硝基水楊酸(DNS)反應，產生顏色變化，這種顏色變化與釋放的還原糖量成正比關系，即與酶樣品的酶活性成正比關系。通過用FPA酶活性來評價初篩菌株對纖維素降解能力的大小，從而確定纖維素功能降解菌株。通過實驗表明:c3b1-3菌株的FPA酶活性最好，分別為19.09 μg/(mL·h)，被確定為纖維素功能降解功能菌株(表3)。CaCO32，K2HPO40.5，MgSO40.5，剛果紅0.1，蛋白胨5，酵母膏5，纖維素5，微量元素溶液0.5 mL(微量元素溶液成分(g/L):ZnSO40.30，CaCl20.25，CuSO40.25，FeSO40.20)，50℃靜置培養。

2.5 高效菌株鑒定

2.5.1 表面形態特征及生理生化特征c3b1-3菌株菌落呈黃白色，表面濕潤、光滑，邊緣不整齊;桿菌，革蘭染色陰性，周生鞭毛，輕微彎曲的桿狀，大小0.59 μm×1.64 μm。c3b1-3菌株生理生化測定結果(表5):c3b1-3菌株生長溫度范圍為15～45℃，生長的pH范圍為5～9，能夠耐受7%的氯化鈉，c3b1-3菌株可能為金黃桿菌屬(Chryseobacterium sp.)。

2.5.2 分子鑒定通過測序與比對，c3b1-3菌株rDNA 16S序列與Chryseobacteriumsp.GU 257958.1同源性最高，達到100%。因此，確定c3b1-3菌株為金黃桿菌(Chryseobacterium sp.)(圖1)。

表5 c3b1-3菌株的生理生化特征Table 5 Physiological and biochemical characteristics of c3b1-3 strain

圖1 c3b1-3菌株16S rDNA序列同源進化樹Fig.1 Homologous evolutionary tree based on the 16S rDNA sequence of c3b1-3 strain

3 小結與討論

微生物分解纖維素的研究早在1912年就開始了，應用研究主要從20世紀60年代開始，利用微生物生產單細胞蛋白和防止環境污染等方面，在纖維素降解菌株篩選、降解機制及應用方面取得了較大成效。在纖維素降解菌的篩選方面，能降解纖維的纖維粘菌(Cytophaga)、纖維桿菌(Cellulomonas)、纖維放線菌(Acidothermus cellulolyticus)、諾卡氏菌屬(Ncardia)及真菌中的木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)等［7-10］，其中從堆肥中分離篩選到的有纖維單胞菌(Cellulomonas sp.)、斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)［11-12］。目前，雖然篩選出不少纖維素降解優勢菌株及組合［13-16］，但在實際堆肥應用方面的效應不是很理想，仍需要進一步篩選出活性高、產酶量大的菌株或群體，從而實現纖維素類物質的資源化利用。

本文針對菠蘿渣肥料化利用出發，通過對多種分離源的纖維素降解菌進行分離、純化和篩選，從菠蘿渣堆制過程中分別獲得了1株纖維素功能降解菌，并對其最佳培養基進行篩選。通過試驗得出以下結論:①利用多種選擇培養基，經過初篩和復篩，從自然發酵不同階段的菠蘿渣中獲得了1株高效降解纖維素菌株c3b1-3;②本實驗通過采用不同培養基對c3b1-3菌株進行培養，獲得了其最適功能培養基為蛋白胨纖維素培養基。通過對其形態、生理生化特征和分子綜合鑒定確定出c3b1-3菌株為金黃桿菌屬(Chryseobacterium sp.);③c3b1-3菌株的降解效率及其分解的最佳溫度等條件還需做進一步的研究。

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