氟苯尼考琥珀酸鈉抗菌活性研究

秦光成，李逐波，張聰，劉暢，楊鵬，陳力學*

(1.重慶醫科大學附屬第一醫院實驗研究中心，重慶400016;2.西南大學藥學院，重慶400716;3.第三軍醫大學動物中心，重慶400038)

氟苯尼考(florfenicol，F)是第三代氯霉素類廣譜抗生素，但由于水溶性較差，約為1.3 mg/mL，在臨床上的使用受到了一定的限制。經過前期研究得到氟苯尼考的一種水溶性前藥氟苯尼考琥珀酸酯(florfenicol succinic，Fs)，其鈉鹽氟苯尼考琥珀酸鈉(florfenicol Sodium succinic，Fs-Na)在水溶液中的溶解度可達500 mg/mL，合成工藝簡單，成本低廉，收率穩定，適于工業化大生產［1］。氟苯尼考琥珀酸鈉為氯霉素類廣譜抗生素，是一種白色或類白色的結晶性粉末，分子式為C16H17Cl2NSO7FNa，分子量為481.22，化學命名為2，2-二氯-N-(1-(氟甲基)-2-羥-2-〔4-(甲基磺酰)苯基〕乙基)乙酰胺琥珀酸鈉，化學結構式如圖1。氟苯尼考琥珀酸鈉是根據前藥原理設計合成的。楊鵬等通過體外抑菌實驗的最低抑菌濃度(MIC)對前藥(氟苯尼考琥珀酸酯、鈉)與氟苯尼考(母藥)抗菌活性進行了對比考察，研究表明氟苯尼考經修飾前后體外的MIC有顯著的差異。但后期通過對氟苯尼考的藥代動力學研究發現，前藥氟苯尼考琥珀酸鈉在動物體內能夠迅速轉化為母藥［2］。為了進一步驗證其在體內轉化后的抗菌效果，本文采用微生物法來評價和考察氟苯尼考修飾前后在大鼠體內轉化后的抗菌活性，為臨床前的藥效學實驗提供了一定的理論依據。

圖1 氟苯尼考琥珀酸鈉的結構式Fig.1 The structural of florfennicol sodium succinate

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物清潔級Wistar大鼠4只，雌雄各半，平均體重(200±20)g，購于重慶醫科大學實驗動物中心。實驗前于動物房適應性飼養1周，給藥前停食1 d。

1.1.2 實驗藥品牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉等均為分析純;培養皿、牛津杯洗凈后滅菌備用;氟苯尼考99.6%，購于浙江臺州海翔醫藥化工有限公司;氟苯尼考琥珀酸酯99.7%，西南大學藥學實驗平臺有機合成實驗室合成。

1.1.3 菌株大腸埃希菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、枯草芽胞桿菌(ATCC 6633)、變形桿菌(ATCC 6896)由西南大學藥學院微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 體內抑菌實驗方法的建立體內抑菌試驗采用微生物法［3-6］，實驗動物采用大鼠，按30.0 mg/kg分別肌注氟苯尼考及其前藥(按氟苯尼考30.0 mg/kg載藥量給藥)。藥后按不同時間段從大鼠尾靜脈采血0.5 mL，置于經肝素鈉抗凝處理的1.5 mL離心管中，3 000 r/min離心15 min后，分離血漿備用進行抑菌試驗，通過抑菌圈直徑的大小來對前藥氟苯尼考琥珀酸鈉與母藥氟苯尼考進行對比研究，考察前藥經過體內酶轉化成氟苯尼考后的抑菌效果，并根據母藥的標準曲線可以推測不同時間段大鼠體內氟苯尼考血藥濃度。標準曲線的制備:取氟苯尼考用pH 7.0磷酸鹽緩沖液配制，與空白血漿依次配制濃度為16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL的7種加標血漿。分別取加標血清100 μL加到制備同一碟中的4只牛津杯中，平行做3只培養皿。按條件培養后測量抑菌圈直徑，算各濃度加標血漿抑菌圈直徑的均值(φ)，以各加標血清濃度(C)對數與相應的菌圈直徑作線性擬合，得到φ-lgC方程在16～0.25 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系，其回歸方程分別為:大腸埃希菌φ=11.105lgC+15.486(R2=0.990 2);金黃色葡萄球菌φ=14.522lgC+13.943(R2=0.996 8);枯草芽胞桿菌φ=14.04 7lgC+15.486(R2=0.998 7);變形桿菌φ=13.288lgC+14.333(R2=0.995 3)。

圖2 氟苯尼考對大腸埃希菌抑菌效果標準曲線Fig.2 The standard curves of restrain effect of FF to EC

圖3 氟苯尼考對變形桿菌抑菌效果標準曲線Fig.3 The standard curves of restrain effect of FF to PV

圖4 氟苯尼考對枯草芽胞桿菌抑菌效果標準曲線Fig.4 The standard curves of restrain effect of FF to BS

圖5 氟苯尼考對金黃色葡萄球菌抑菌效果標準曲線Fig.5 The standard curves of restrain effect of FF to SA

1.2.2 方法回收率與精密度按照標準曲線制備項下的方法制備濃度分別為16、8、0.8 μg/mL高、中、低3種濃度的加標血漿，按照供試樣測定方法測定，每種樣品平行測定3次和在不同日期測定3次，計算它們的日內與日間精密度，并代入標準曲線計算各樣品的回收率。

表1 方法回收率與精密度Table 1 Method precision and recovery

方法相對回收率與精密度見表1。由表1可知，高、中、低3種藥物濃度的相對回收率在99%～106%之間，RSD＜10%。

1.2.3 生物樣的測定將配好的普通肉湯瓊脂培養基及平皿高壓滅菌，當溫度降至50℃左右時，取20 mL于平皿中制成平面，4℃保存。分別用肉湯將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、枯草芽胞桿菌稀釋為標準菌液備用。用高壓滅菌的棉棒分別將菌液均勻涂布于平板上，平皿瓊脂上放置牛津杯。然后在給藥后0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36 h采血按“1.2.1”血漿處理方法處理分離血漿，取血漿100 μL加入到牛津杯中，置37℃培養箱內培養18～24 h，觀察抑菌圈大小。

1.2.4 統計學分析采用SPSS 12.0統計軟件，對兩獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 氟苯尼考及氟苯尼考琥珀酸鈉對4種不同敏感菌抑菌效果對比

氟苯尼考及氟苯尼考琥珀酸鈉對4種不同敏感菌抑菌效果對比見圖6、7、8及圖9。

圖6 F及Fs-Na對枯草芽胞桿菌的體內抑菌效果對比圖Fig.6 An in vivo inhibition zone of F and Fs-Na against BS

圖7 F及Fs-Na對大腸埃希菌的體內抑菌效果對比圖Fig.7 An in vivo inhibition zone of F and Fs-Na against EC(mm)

圖8 F及Fs-Na對變形桿菌的體內抑菌效果對比圖Fig.8 An in vivo inhibition zone of F and Fs-Na against PV

圖9 F及Fs-Na對金黃色葡萄球菌的體內抑菌效果對比圖Fig.9 An in vivo inhibition zone of F and Fs-Na against SA(mm)

2.2 氟苯尼考琥珀酸鈉在大鼠體內不同時間點轉化情況

表2 氟苯尼考與氟苯尼考琥珀酸鈉體內抗菌效果對比研究Table 2 In vivo antibacterial activity of F and Fs-Na expressed as inhibition zone(mm)

氟苯尼考與氟苯尼考琥珀酸鈉的抗菌效果對比情況見表2。由表2可以看出，氟苯尼考及氟苯尼考琥珀酸鈉經動物體轉化后，從0～3 h這段時間內，抑菌圈直徑(mm)以及血藥濃度C*是相當的，故其抗菌效果是相當的，但前藥較母藥在給藥4 h后抗菌能力有一定的下降，但統計學分析表明P＞0.05差異不顯著，同時給藥12 h后兩者幾乎都沒有抗菌活性。并根據標準曲線，可以初步推算出血漿中氟苯尼考的血藥濃度，給藥1 h后可以達到最大血藥濃度(4.0 μg/mL)。

3 討論

楊鵬等［7］通過體外抑菌實驗的最低抑菌濃度(MIC)對前藥(氟苯尼考琥珀酸酯、鈉)與氟苯尼考抗菌活性進行了對比考察，研究表明氟苯尼考經修飾前后體外的MIC有顯著的差異，其中研究結果還表明對金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌敏感度降低了64倍，對變形桿菌、大腸埃希菌降低了128倍。因此根據前藥原理可以得知母藥成功潛伏化，符合前藥設計要求［8］。

從表2可以看出，前藥與母藥從給藥后0～3 h這段時間內其抑菌圈直徑以及血藥濃度C*是相當的，且在1～1.5 h能達到最大血藥濃度為4.0 μg/mL，說明前藥和母藥對4種細菌都有良好的抗菌活性，且效果相當。這恰好驗證了前藥在體外活性較低或者無活性，注射到動物體內后，在體內各種酶的作用下能夠迅速轉化為母藥氟苯尼考發揮其抗菌活性的前藥原理。因此說明氟苯尼考琥珀酸鈉作一種前藥在大鼠體內能迅速轉化為氟苯尼考母藥而發揮其抗菌活性，這與通過HPLC對氟苯尼考琥珀酸鈉的藥代動力學研究的結果是一致的［2］。通過對氯霉素類抗生素基本骨架構效關系分析，要期望用化學方法通過化學結構修飾引入小分子載體來提高其水溶性而不改變其生物活性，研究證實要達到此目的，只能在氟苯尼考分子結構的芐仲羥基位置進行結構修飾，同時也證明了芐仲羥基為氟苯尼考發揮抗菌作用的一活性基團。

但前藥較母藥在給藥4 h后抗菌能力有一定的下降，血藥濃度也有一定差異，可能是由于前藥在轉化的同時一部分也在代謝，但統計學分析表明差異并不顯著(P＞0.05)。動力學研究表明［2］，最大血藥濃度可以達到6.28 μg/mL，且在給藥72 h后還能檢測到血漿中氟苯尼考濃度為0.17 μg/mL，與本文研究的最大血藥濃度為4.0 μg/mL和給藥后12 h不能夠檢測到氟苯尼考有一定差異，這種差異可能是因為藥物與血漿蛋白結合不能良好的發揮其抗菌活性，影響了抑菌圈的大小。同時這也可能是由于實驗動物的個體差異以及給藥的季節差異等諸多方面因素影響造成的。且前期對氟苯尼考琥珀酸鈉的局部毒性試驗考察表明，在其臨床的使用劑量內是安全的［9］。所以通過化學結構修飾得到的氟苯尼考琥珀酸鈉在不改變其藥理活性的情況下，從根本上解決了氟苯尼考水溶性低，使用有機溶劑做助溶劑使得局部連續給藥刺激性大的難題，為氟苯尼考在臨床上進一步的廣泛推廣奠定了良好的基礎，然而其在靶動物的有效性還有待于進一步研究。

［1］ 秦光成，陳力學，李逐波.氟苯尼考琥珀酸單酯的合成工藝優化［J］.合成化學，2010，18(1):121-123.

［2］ 秦光成，陳力學，李逐波.氟苯尼考琥珀酸鈉在大鼠體內的藥代動力學研究［J］.西南大學學報(自然科學版)，2010，32(7):161-166.

［3］ 唐欣，錢平利，溫泉，等.微生物法測定阿齊霉素的血藥濃度［J］.武警醫學，2004，15(11):806-807.

［4］ 顏喜亞.微生物法測定青霉素殘留量的研究［J］.河北省科學院學報，2006，23(2):84-86.

［5］ 陳淑云，沈琴華，王勇.微生物法測定環丙沙星片在人體中的藥物動力學和生物利用度［J］.中國醫院藥學雜志，1993，13(9):389-390.

［6］ 簡潔.微生物測定阿米卡星血藥濃度［J］.桂林醫學院學報，1996，102:203-204.

［7］ 楊鵬.氟苯尼考琥珀酸鈉的合成與藥理作用初探［D］.西南大學碩士學位論文，2008.

［8］ Valentino J Stella，Kenneth J Himmelsteisn.Prodrug and sitespecific drug delivery［J］.J Med Chem，1980，23(12):1275-1282.

［9］ 秦光成，李逐波.氟苯尼考水溶性前藥局部毒性研究［J］.獸藥與飼料添加劑，2009，14(2):1-4.