微生物絮凝劑產生菌固定化條件的優化

王蘭，趙璇

(南開大學環境科學與工程學院，天津300071)

微生物絮凝劑是利用生物技術，從微生物或其分泌物中分離、提取得到的新型高分子絮凝劑，具有可生物降解、高效安全、無毒和無二次污染等優點，因而近年來倍受各國水處理工作者的重視［1-5］。但絮凝劑用量大、成本高等問題給微生物絮凝劑在工業上廣泛應用造成了巨大障礙［3-9］。固定化微生物技術是20世紀60年代發展起來的一門新興生物技術，在化工、發酵生產、能源、醫藥等行業廣泛應用，效果顯著［10-12］。它是利用物理或化學的手段將游離微生物細胞定位于限定的空間區域，并使其保持活性反復利用的方法。固定化微生物技術與傳統的懸浮生物處理法相比，具有效率高、反應易控制、微生物的高效高密度、固液分離效果好、對環境的耐受力強等優點［13-14］。利用固定化微生物技術可以提高菌體利用率，提高產量［14］，鑒于此，本文對微生物絮凝劑產生菌的固定化方法及固定化條件進行研究，比較了利用固定化菌和游離菌所產絮凝劑的絮凝效果，并對生產和使用過程中該絮凝劑的穩定性進行探討，旨在為降低生產成本，提高生產效率，以便將來應用于廢水生物處理中，取代傳統的化學絮凝劑，為工業化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種微生物絮凝劑產生菌M09，本實驗室篩選，經鑒定為醬油曲霉(Aspergillus sojae)，斜面保存。

1.1.2 固定化載體材料多孔聚氨酯泡沫、秸稈芯兒、玉米棒芯兒、棉線與多孔吸附樹脂(SH-1，RD和NR)

1.1.3 培養基(質量分數，%)NaNO30.3，KCl 0.05，K2HPO40.1，FeSO40.001，MgSO4·7H2O 0.05，蔗糖3，pH 5.0～5.5;以上培養基加入瓊脂2%即為固體培養基。培養基采用高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為121℃，15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種M09的液體培養方法250 mL三角瓶中裝入75 mL培養基，滅菌冷卻后，接入斜面菌種，29℃150 r/min振蕩培養72 h所得發酵液即為高絮凝活性的微生物絮凝劑。

1.2.2 菌種M09的固定化方法①表面吸附法:將事先經過預處理的固定化載體，按照一定的固液比投入1.1.3培養基中共同滅菌，冷卻后接入M09孢子懸液，于28℃恒溫振蕩培養60 h后，菌體即吸附于載體表面，得到固定化菌體;②海藻酸鈉包埋法:將一定濃度的菌懸液和2%海藻酸鈉溶液混合，用注射器緩慢勻速地滴入濃度為1%CaCl2溶液中，形成直徑為2～3 mm的固定化小球，滴完后于28℃固定4 h，再將小球用無菌水洗滌2～3次，最后放入濃度為1%戊二醛溶液中于4℃硬化24 h［12］。

1.2.3 微生物細胞固定化條件的優化固定化條件包括載體顆粒大小(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm與1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm)，固定化載體重量與培養基體積之比(固液比)(3、4、5與6 g/L)，固定化培養基的碳源(果糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉)，培養基初始蔗糖濃度(1%、2%、3%)及培養基碳氮比(蔗糖∶NaNO3)(3∶1(2%∶0.67%)、5∶1(2%∶0.4%)、10∶1(2%∶0.2%))。

1.2.4 微生物絮凝率的測定方法用量筒量取高嶺土懸浮液(4 g/L)60 mL置100 mL燒杯中，加入0.4 mL測試發酵液，在四聯電動攪拌器上進行攪拌，快速攪拌(400 r/min)1 min，慢速攪拌(50 r/min)5 min，然后靜置5 min，取上清液用分光光度計在550 nm處測定其吸光度。用蒸餾水代替發酵液作為空白對照，樣液做3個平行。絮凝活性用絮凝率來表征，其計算方法如下:

式中:Ⅰ為絮凝率;A為待測樣品的OD550nm值;B為對照組的OD550nm值。

1.2.5 發酵液中殘留蔗糖的測定蔗糖的測定采用鹽酸水解法，使蔗糖水解成還原糖后用斐林試劑法測定水解得到的還原糖含量［15］。

2 結果與分析

2.1 不同固定化方法對M09產絮凝劑的影響

按照1.2.2方法對菌M09進行固定化，將固定化的菌以一定的固液比加入到1.1.3培養基中，28℃150 r/min振蕩培養，在不同時間點取發酵液測得絮凝率見圖1。

圖1 不同固定化方法對M09菌產絮凝劑的影響Fig.1 Effect of immobilized ways on bioflocculant production of M09

由圖1可知，采用吸附法所得固定化細胞發酵上清液的絮凝效果要好于采用包埋法固定化細胞。這可能是因為包埋法的微生物細胞被包埋在載體內部，影響了傳質效果，進而影響了微生物的活性［11-13］;或是較高的CaCl2產生了高滲透壓作用，引起細胞脫水，致使微生物活性部分喪失［14］;或是交聯時間的原因，因為交聯時間越長，所得固定化凝膠小球的強度越高，內部結構更為緊密，不利于基質的傳遞，從而使細胞失活率增大［13］。因此以下實驗皆選用表面吸附法做為菌M09的固定化方法。

2.2 不同固定化載體對微生物產絮凝劑的影響

選用的固定化載體有多孔聚氨酯泡沫、秸稈芯、玉米棒芯、棉線與大孔吸附樹脂(SH-1、RD和NR)。將各固定化載體投加到含有100 mL固定化培養基的250 mL的錐形瓶中，121℃20 min滅菌后，接入M09菌，28℃150 r/min固定化培養60 h后，測定各發酵上清液的絮凝率如表1。

表1 不同固定化載體對微生物產絮凝劑絮凝活性的影響Table 1 Effect of immobilized carrier on bioflocculant production

由表1可知，以多孔聚氨酯泡沫做為固定化載體的發酵上清液絮凝活性最高，絮凝率達到91.45%;其次是大孔吸附樹脂RD、SD-1與玉米棒芯，絮凝率分別為89.55%、88.45%與80.79%。試驗過程中發現，以大孔吸附樹脂為載體的固定化效果較差，絕大部分的M09菌游離在發酵上清液中;玉米棒芯處理的發酵上清液渾濁不清，因此選擇采用多孔聚氨酯泡沫做為M09菌的固定化載體。

2.3 菌M09固定化條件的優化

2.3.1 載體顆粒粒徑對菌M09固定化及絮凝效果的影響試驗選用2種多孔聚氨酯泡沫顆粒粒徑(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm與1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm)，采用表面吸附法進行菌M09固定化培養，得到固定化菌體細胞并加入滅菌后的培養基，于28℃、150 r/min振蕩培養，其后每隔12 h

測定絮凝率并更換一次發酵培養基，計作1批，試驗持續了72 h，共6批，每批次做3個重復，平均后得結果見圖2。圖2表明，在發酵最初2批次，2處理的絮凝效果均較好，絮凝率均在86%以上。隨著發酵批次的增加，載體顆粒粒徑小的處理發酵上清液絮凝效果明顯好于載體粒徑大的發酵上清液絮凝效果，且這種差異隨批次增加逐漸呈增大趨勢;觀察菌體的固定化情況發現，培養最初，尚有部分菌絲游離分散在培養液中，大約發酵3個批次后，菌絲體幾乎全部吸附在載體上，載體上固定菌絲由最初的半透明狀變為白色，而載體顆粒粒徑較大的處理培養基中有游離的菌絲體，這可能是由于單位重量載體粒徑越大，其總的表面積越小，可用于固定化菌吸附的空間越小，以致那些沒有固定上的菌體隨著培養基的更換而流失減少了，最終影響了絮凝劑的產量，此現象隨著發酵批次的增加愈加明顯。因此以下試驗則選用固定化載體顆粒粒徑為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。

圖2 載體顆粒粒徑對菌M09產生絮凝劑絮凝效果的影響Fig.2 Effect of immobilized carrier size on bioflocculant production

2.3.2 固液比對菌M09固定化及絮凝效果的影響試驗選用3、4、5與6 g/L 4種固液比，接入菌M09，置于28℃、150 r/min下振蕩培養60 h，將所得固定化菌體加入滅菌后的發酵培養基，于28℃、150 r/min振蕩培養，其后每隔12 h測定絮凝率并更換一次發酵培養基，計作1批，試驗持續72 h，共6批，每批次做3個重復，平均后的結果見圖3。由圖3可知，在發酵最初3批次，各處理的絮凝效果均較好，絮凝率均在89%以上。隨著發酵批次的增加，固液比為4 g/L和5 g/L的發酵上清液絮凝效果明顯好于其他處理的發酵上清液絮凝效果。觀察菌體的固定化情況發現，培養至第4批時，3 g/L處理的發酵上清液中出現了懸浮的菌絲體，這可能是導致絮凝劑產量減少，絮凝率下降的原因;而6 g/L處理的發酵上清液絮凝率減小，可能是因為培養基中的營養不能滿足載體上不斷增多的菌絲體合成絮凝劑的需要，而導致部分菌體死亡，進而使絮凝劑產量減少，絮凝效果下降。因此考慮到經濟及效果等原因，以下試驗均采用4 g/L固液比。

圖3 固液比對菌M09產絮凝劑絮凝效果的影響Fig.3 Effect of ratio of solid to liquid on bioflocculant production

2.3.3 不同碳源對菌M09固定化及絮凝效果的影響采用1.1.3中的培養基，只改變其中的碳源種類，滅菌后接種菌M09，置于28℃、150 r/min的振蕩培養箱中培養，固定化培養60 h后分別測各培養液的絮凝率，結果見表2。

表2 不同碳源對絮凝劑產生的影響Table 2 Effect of different carbon source on bioflocculant production

由表2可知，采用蔗糖作為碳源的培養基所得培養液絮凝效果最好，絮凝率達到87.2%;其余各處理培養液絮凝率均在80%以下，其中以可溶性淀粉作為碳源的培養基所得培養液絮凝率最小，為12.3%，這可能是由于菌M09攝取碳的生理途徑、碳源進入細胞的方式及數量多少的不同而引起的［16-18］。因此，以下實驗選用的培養基碳源為蔗糖。

2.3.4 初始蔗糖濃度對菌固定化及絮凝效果的影響將M09菌接入初始蔗糖濃度為1%、2%與3%的培養基中，置于28℃，150 r/min的搖床中培養，分別考察培養時間為24、36、48、60、72、84、96 h的發酵上清液的絮凝率(a)與殘糖(蔗糖)量(b)。結果見圖4。

圖4 初始蔗糖濃度對產絮凝劑絮凝效果的影響Fig.4 Effect of initial sugar concentration on bioflocculant production

從圖4中看出，利用蔗糖濃度為1%的培養基固定化培養M09菌48 h后，上清液絮凝活性最高，絮凝率達到78.51%，繼續培養至96 h，絮凝活性呈下降趨勢。利用蔗糖濃度2%與3%的固定化培養基，在最初培養的24 h內，2處理絮凝率差別不大，繼續培養至60 h，前者的絮凝率明顯優于后者，且2處理在培養60 h時絮凝率達到最大，分別是89.10%和83.45%;而此時2處理發酵上清液中殘糖分別為0.91%和1.56%，由此可明顯看出，利用3%蔗糖濃度，其發酵上清液中殘糖濃度過高，造成了浪費，故在以后的試驗中即采用2%作為培養基的初始蔗糖濃度。

2.3.5 培養基碳氮比對菌固定化及絮凝效果的影響為了確定最優的培養基碳氮比，實驗分別以碳氮比(蔗糖:NaNO3)為3∶1(2%∶0.67%)、5∶1(2 %∶0.4%)、10∶1(2%∶0.2%)的培養基對M09菌進行振蕩培養，并在培養至36、48、60、72 h取樣測定培養液絮凝率，結果見表3。由表3可以看出，隨著碳氮比的增大，培養液絮凝率呈現逐漸下降的趨勢，碳氮比為3∶1培養液絮凝效果最好，在培養72h后培養液絮凝率可達91.3%，而碳氮比為5∶1、10∶1分別為90.2%、89.6%。考慮到碳氮比為5∶1在培養至48 h培養液絮凝率已近90%，綜合考慮成本，選擇培養基的碳氮比為5∶1。

表3 培養基碳氮比對絮凝劑產生的影響Table 3 Effect of different C/N ratio of culture medium on bioflocculant production

2.4 利用優化條件進行M09菌的固定化試驗

采用以上優化的固定化條件(利用粒徑為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的聚氨酯泡沫為固定化載體，4 g/L的固液比，使用初始蔗糖濃度為2%，NaNO3為0.4%的培養基，28℃振蕩培養)對M09菌進行固定化，可以觀察到，在固定化培養初期，部分菌絲游離分散在培養液中，培養約30 h后菌絲部分附著在載體上，載體由最初的黑色變為白色。培養至60 h，培養液透亮，呈淡綠色，而菌絲則完全附著在載體上，載體的吸附效率相當高，這可能是因為載體表面比較粗糙，易于被菌絲吸附，不易脫離?？梢姡么朔椒▽鶰09進行固定化是可行的，固定了菌M09前后的載體見圖5。

圖5 固定菌M09前后的載體Fig.5 Contrast between the original carrier and the carrier of immobilized M09

2.5 利用游離菌與固定化菌所產絮凝劑絮凝效果的比較

分別利用固定化菌和游離菌進行發酵實驗，所得發酵液絮凝效果比較見圖6。由圖6可以看出，固定化菌培養2 h后即可獲得絮凝活性較高的發酵上清液，其絮凝率達70.3%，繼續培養至8 h，絮凝率達到86.9%;而游離菌的發酵上清液絮凝效果較差，4 h絮凝率僅達24.0%，繼續培養至8 h，絮凝率才有較明顯的上升，培養至12 h時絮凝率達到78.7%。由此說明在同樣的接種量及相同培養條件下，固定化菌的發酵上清液絮凝活性大大高于游離菌發酵上清液的絮凝活性，所以采用固定化菌生產微生物絮凝劑具有明顯的優勢。

圖6 游離菌與固定化菌產絮凝劑絮凝效果的比較Fig.6 Comparison of flocculating activity of free and immobilized M09

2.6 不同存儲條件對具有高絮凝活性發酵液絮凝活性的影響

具有高絮凝活性的發酵液在生產或使用過程中，常常會遇到不能及時處理或使用，需存放一段時間的情況，那么，研究不同存儲條件對其絮凝活性的影響就顯得尤為重要。不同存儲條件下發酵液的絮凝活性變化見圖7。由圖7可以看出，不同存儲條件下發酵液的絮凝活性差別很大，其中在室溫(25℃左右)保存下，發酵上清液(不含菌體)的絮凝率下降最快，3 d后的絮凝率降低至12.2%，幾乎沒有絮凝效果;而含有菌體的發酵液的絮凝率沒有下降，一直維持在90%以上，這可能是因為在此條件下菌體還能不斷產生絮凝劑，從而在一定程度上彌補了絮凝活性的下降。在4℃下保存的各處理絮凝率也有一定程度的下降。因此，利用固定化菌生產絮凝劑后期，所產高絮凝活性發酵液若不能及時處理或使用可將其存放在反應器中，停止通氣，防止雜菌污染，發酵液絮凝率仍可緩慢持續上升，維持較高水平達數日，具有高度的穩定性。

圖7 不同存儲條件對發酵液絮凝活性穩定性的影響Fig.7 Effect of condition of storage on flocculating activity

3 結論

對微生物固定化方法與固定化載體進行選擇，研究表明吸附法是固定M09菌的最佳方法，多孔聚氨酯泡沫是固定化菌的良好載體，具有經濟、高效的特點。

通過單因子實驗對絮凝劑產生菌M09固定化條件進行優化，綜合考慮絮凝效果和經濟成本，最終所得優化的固定化條件:選用粒徑為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的多孔聚氨酯泡沫為固定化載體，4 g/L的固液比，使用初始蔗糖濃度為2%，NaNO3為0.4%的培養基，28℃振蕩培養，菌體可在較短時間內全部吸附在載體上，可獲得較高活性的固定化細胞，發酵上清液能夠保持較高的絮凝活性，絮凝效果最好。研究還發現，固定化菌的發酵上清液絮凝活性大大高于游離菌的發酵上清液，所以采用固定化菌體生產微生物絮凝劑具有明顯的優勢。

具有高絮凝活性的發酵液在不同存儲條件的絮凝活性穩定性不同，其中在室溫保存下，含有菌體的發酵液在靜止條件下絮凝活性可保持數日，這可能是因為在此條件下菌體能不斷產生絮凝劑，從而在一定程度上彌補了絮凝活性的下降。因此，利用固定化菌生產絮凝劑后期，所產生高活性發酵液若不能及時處理或使用可將其存放在反應器中，自然靜置，防止雜菌污染，在室溫下保存數天，仍可維持較高的絮凝活性，具有高度的穩定性，不需要特殊的保存條件與手段，這樣可降低工藝成本，節約設備運營能源，既提高了效率，也為其工業化生產和應用提供了便利。

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