曲古菌素A對FcεRI介導的肥大細胞活化的影響

王慶輝，呂昌龍*，單風平，劉軍

(1.中國醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，遼寧沈陽110001;2.中國醫科大學免疫研究所，遼寧沈陽110001)

抗變應原的特異性抗體IgE與肥大細胞表面表達的IgE高親合力受體FcεRI交聯，形成IgE/FcεRI復合物，活化肥大細胞。進而活化的肥大細胞通過釋放其儲存的組胺等生物活性介質或者新合成的TNF-α、IL-6和IL-13等細胞因子，引發變態反應的發生?；虮磉_調控與染色體上組蛋白乙?；臓顟B有關。這種狀態受控于2種關鍵的調節因子，即組蛋白乙?；?Histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDAC)。HAT和HDAC通過轉移或者移除位于組蛋白NH2端的賴氨酸殘基的乙?；鴮崿F對某一基因的轉錄調控。在正常情況下，HAT和HDAC的調控作用處于平衡狀態，一旦細胞發生轉化，這種平衡被打破，一些細胞增殖和細胞周期的相關調控分子表達失衡，進而導致細胞癌變［1］。近年來，曲古菌素A(Trichostatin A，TSA)作為一種組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylase inhibitors，HDACi)，能夠抑制腫瘤細胞的生長，或者誘導腫瘤細胞的分化和凋亡［2-4］，而成為新一代抗癌制劑;還可通過調節各種基因的表達，糾正系統性紅斑狼瘡［5-6］、類風濕性關節炎［7］等免疫性疾病的免疫失衡。特別是在變態反應性哮喘的小鼠模型中，TSA通過減少Th2型細胞因子分泌以及支氣管肺泡灌洗液中IgE的表達，減輕過敏性氣道炎癥反應，顯示了潛在的治療效應［8］。然而，TSA是否能夠影響變態反應的重要效應細胞—肥大細胞的活化，卻鮮有報道。為此，本實驗體外觀察曲古菌素A對FcεRI誘導小鼠骨髓來源的肥大細胞活化的影響，旨在為肥大細胞相關的變態反應的研究提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物6～8周齡，雌性，BALB/c小鼠(本校實驗動物部提供)。

1.1.2 主要試劑TSA(Sigma);RPMI 1640培養基(Thermo);FCS(Biological Industries，Haemek，Israel);PWM刺激的脾細胞培養上清(本實驗室制備);Tyrode’s緩沖液;Triton;p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucopyranoside(Sigma);小鼠IgE、小鼠anti-IgE抗體(eBioscience);2.4G2(PharMingen);小鼠PE-anti FcεRI抗體(MAR-1，eBioscience);小鼠FITC-anti c-kit抗體(Pharmingen);propidium iodide(PI)、Annexin V-FITC(BD Biosciences);IL-6、TNF-α和IL-13 ELISA試劑盒(R＆D Systems，Minneapolis，MN)。

1.1.3 主要儀器FACSCalibur流式細胞儀(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，N.J.，USA);酶標儀(InterMed NJ-2100);CO2孵箱(Harasawa，Japan)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓來源的肥大細胞(bone marrow-derived mast cells，BMMC)的制備BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡。無菌鈍性分離小鼠雙側股骨，用1 mL注射器吸取少量RPMI-1640培養液沖洗股骨骨髓內細胞至無菌平皿中。收集細胞至10 mL離心管中，1 000 r/min，4℃離心5 min，棄上清。用10 mL BMMC培養液(含10%PWM刺激的脾細胞培養上清的10%FCS-RPMI 1640培養液)重懸細胞，移至10 cm無菌培養皿，于37℃，5%CO2孵箱孵育。常規換液，培養4周后待用［9］。

1.2.2 ELISA試劑盒檢測細胞因子調制小鼠BMMC濃度至1×106/mL，于50 nmol/L TSA 37℃，5%CO2孵箱孵育24 h。細胞經1 μg/mL IgE于4℃致敏1 h之后，再經1 μg/mL anti-IgE抗體于37℃，5%CO2孵箱孵育3 h(TNF-α)或6 h(IL-6和IL-13)，同時設未加anti-IgE抗體的陰性對照孔。收集培養上清，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟分別檢測培養上清中TNF-α、IL-6和IL-13的分泌水平，每份標本設3個復孔。用酶標儀測定樣本OD450值。以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，計算細胞因子含量(pg/mL)。

1.2.3 脫顆粒檢測50 nmol/L TSA孵育的并經1 μg/mL IgE致敏的1×106/mL小鼠BMMC重懸于Tyrode’s緩沖液中，經1 μg/mL anti-IgE抗體37℃刺激45 min后，收集上清液。加入p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucopyranoside作為底物37℃顯色90 min，經酶標儀測定OD405值(ODsample)。IgE致敏細胞經2%Triton處理的培養上清液的OD值作為細胞顆粒的最大釋放量(ODtotal)。IgE致敏細胞經Typrode’s緩沖液孵育的上清液的OD值為ODbase。β-氨基己糖苷酶的釋放量(%)=(ODsample－ODbase)/(ODtotal－ODbase)×100%。

1.2.4 流式細胞儀(FACS)檢測收集BMMC，經2.4G2阻斷細胞表面Fc受體后，與小鼠PE-anti FcεRI抗體和小鼠FITC-anti c-kit抗體4℃避光孵育1 h，PBS洗細胞2遍，用FACSCalibur流式細胞儀分析細胞表面FcεRI和c-kit表達，鑒定肥大細胞的純度。BMMC經50 nmol/L TSA于37℃孵育24 h或48 h。24 h后收集細胞，經2.4G2封閉，加入PE-anti FcεRI抗體，4℃避光孵育1 h，PBS洗細胞后，FACSCalibur流式細胞儀分析細胞表面FcεRI表達;48 h后收集細胞，經5 μg/mL propidium iodide(PI)和Annexin V-FITC室溫染色15 min，FACSCalibur流式細胞儀分析BMMC的凋亡。

2 結果與分析

2.1 肥大細胞的表型鑒定

小鼠骨髓細胞培養4周后，經流式細胞儀檢測，大于95%的細胞表達成熟肥大細胞的特異性表型(FcεRI+/c-kit+)，提示細胞已培養為成熟的BMMC(見圖1)。

圖1 BMMC特異性表面分子的表達Fig.1 The expressions of specific markers on BMMC

圖2 TSA對BMMC脫顆粒的影響Fig.2 The effect of TSA on the degranulation of BMMC

2.2 TSA對IgE交聯誘導肥大細胞脫顆粒的影響

FcεRI介導活化的肥大細胞可迅速釋放組胺等生物活性介質。由于β-氨基己糖苷酶與組胺的釋放呈一致性，因此，常被用來檢測肥大細胞脫顆粒能力。小鼠BMMC分別經50 nmol/L TSA 37℃孵育24 h后，經1 μg/mL IgE/anti-IgE體外刺激，并檢測細胞β-氨基己糖苷酶的釋放量。結果顯示，未經TSA孵育的BMMC的β-氨基己糖苷酶的釋放可達到(50.44±1.63)%，TSA孵育后，BMMC β-氨基己糖苷酶的釋放顯著被抑制(圖2)，表明TSA可降低FcεRI介導的BMMC脫顆粒能力。

2.3 TSA對IgE交聯誘導肥大細胞分泌細胞因子的影響

如表1所示，正常小鼠BMMC經1 μg/mL IgE/anti-IgE體外刺激后，培養上清中TNF-α、IL-6和IL-13的分泌顯著升高(Control組)，表明IgE/anti-IgE刺激可誘導肥大細胞分泌炎性細胞因子;而經TSA孵育后，IgE/anti-IgE刺激誘導BMMC分泌TNF-α、IL-6和IL-13的能力顯著降低，提示TSA可抑制小鼠FcεRI介導活化的BMMC分泌炎性細胞因子。

2.4 TSA對肥大細胞FcεRI表達的影響

小鼠BMMC經50 nmol/L TSA 37℃孵育24 h后，FACS檢測細胞表面FcεRI的表達。結果顯示，與未經TSA孵育的BMMC相比，TSA孵育后的BMMC FcεRI平均熒光強度顯著降低(圖3)，表明TSA可抑制肥大細胞FcεRI的表達。

圖3 TSA對BMMC FcεRI表達的影響Fig.3 The effect of TSA on the expression of FcεRI on BMMC

圖4 TSA對肥大細胞凋亡的影響Fig.4 The effect of TSA on the apoptosis of BMMC

2.5 TSA對肥大細胞凋亡的影響

如圖4所示，50 nmol/L TSA孵育48h后，Annexin V-FITC+/PI-細胞即凋亡細胞的比例明顯增加，提示TSA可誘導肥大細胞凋亡。

表1 TSA對FcεRI介導的BMMC分泌細胞因子的影響Table 1 Effect of TSA on the productions of cytokines from FcεRI-mediated BMMC

3 討論

目前，變態反應患者的數量在全世界范圍內與日俱增。變應原誘導機體產生特異性抗體IgE，形成抗原抗體復合物，進而與肥大細胞表面FcεRI交聯，活化肥大細胞，并促使其釋放生物活性介質，是引發變態反應的關鍵環節。因此，以變態反應的效應細胞—肥大細胞為靶點，研制調控肥大細胞活化的相關制劑，是控制變態反應性疾病發生和進展的重要手段之一。報道顯示，組蛋白去乙?；敢种苿猅SA在過敏性疾病和炎癥性疾病過程中發揮一定作用［8］。然而，TSA對肥大細胞的影響卻鮮有報道。本實驗結果顯示TSA可抑制FcεRI-介導的小鼠BMMC活化。

經IgE/FcεRI交聯活化的BMMC可迅速釋放組胺等顆粒性物質，并合成炎癥性細胞因子，發揮其生物學功能。然而，經50 nmol/L TSA孵育后，FcεRI-介導的BMMC的脫顆粒(圖2)以及合成分泌TNF-α、IL-6和IL-13等炎性細胞因子(表1)的能力顯著下降。據報道，TSA能夠選擇性地誘導包括P815肥大細胞瘤在內的多種腫瘤細胞的凋亡［10］，一致的是，本實驗TSA處理后的BMMC FcεRI表面表達降低(圖3)，凋亡細胞數增加(圖4)，由此提示TSA同樣可以誘導正常小鼠肥大細胞的凋亡，下調FcεRI表達，繼而使BMMC活化受到抑制。本實驗結果為TSA在肥大細胞相關的超敏反應性疾病中的應用提供了實驗數據。然而，TSA作用于肥大細胞凋亡和/或FcεRI活化信號路徑上的確切的分子靶位還有待進一步研究。

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