蛹蟲草優(yōu)良菌株的篩選

孫軍德，宋思丹，王穎，房琳琳，白立紅

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽110161)

北冬蟲夏草(Cordyceps militaris(L.)Link)又叫蛹蟲草或北蟲草，屬于子囊菌亞門，核菌綱，麥角菌目，麥角菌科，蟲草屬，是蟲草屬的一個(gè)模式菌種，它是寄生在夜蛾科等蛹體上，與冬蟲夏草同屬不同種［1］。蛹蟲草是我國名貴中藥材的一種，具有很高的食用和藥用價(jià)值［2］。北蟲草中的多糖、蟲草素等成分具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤的作用，經(jīng)過科研人員多年的精心研究，蛹蟲草的人工栽培已經(jīng)達(dá)到工廠化的規(guī)模［3］。本試驗(yàn)通過對(duì)5株蛹蟲草形態(tài)、生長速率、液體培養(yǎng)生物量和胞外多糖、人工栽培和蛹蟲草子實(shí)體多糖、蟲草素的對(duì)比研究，篩選出蛹蟲草的優(yōu)良菌株，為工業(yè)化的大量生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株蛹蟲草1號(hào)、2號(hào)、6號(hào)、B1、K36采自沈陽棋盤山，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基①PDA加富培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，VB10.1g，加水至1 000 mL;②基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，酵母粉2 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL;③液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，MgSO43 g，加水至1 000 mL;④營養(yǎng)液:蛋白胨4.5 g，葡萄糖20 g，加水至1 000 mL;⑤栽培培養(yǎng)基:小麥30 g，自來水50 mL。馬鈴薯處理:去皮后稱重，切塊，水開后繼續(xù)煮0.5 h，8層紗布過濾除渣。培養(yǎng)基滅菌條件:121℃，滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌落培養(yǎng)用直徑5 mm的滅菌打孔器取蛹蟲草菌片接種至PDA平板中央，將平板分別置于培養(yǎng)室自然光照培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。培養(yǎng)5 d后，每隔2 d測(cè)定菌落直徑，計(jì)算不同蛹蟲草菌株的生長速率［4］。

1.2.2 液體培養(yǎng)用無菌的打孔器取相同量的菌片置于液體培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)7 d后，4層紗布過濾，菌絲體60℃烘干至恒重后，測(cè)定不同菌株的生物量，收集濾液，測(cè)定胞外多糖含量。

1.2.3 人工栽培試驗(yàn)將活化后的蛹蟲草菌片接入含有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，往復(fù)震蕩培養(yǎng)7 d，靜置1 d確保無雜菌后，用營養(yǎng)液稀釋5倍即為栽培用液體菌種。在500 mL罐頭瓶中裝入30 g小麥和50 mL自來水，用聚丙烯塑料薄膜封口，常壓滅菌24 h，過夜冷卻，接入5 mL液體菌種，置發(fā)菌室，18℃黑暗條件下發(fā)菌7 d。待菌絲長滿培養(yǎng)基后進(jìn)行22℃光照轉(zhuǎn)色，7 d后完成轉(zhuǎn)色，在塑料封口膜上打孔進(jìn)行出草管理。培養(yǎng)48 d后描述形態(tài)，采收并測(cè)量記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.4 子實(shí)體活性物質(zhì)含量的測(cè)定①多糖含量的測(cè)定:將蛹蟲草子實(shí)體切成小塊，置于烘箱內(nèi)，40℃條件下烘干數(shù)小時(shí)，直至完全干燥。將干燥后的子實(shí)體小塊放入電動(dòng)粉碎機(jī)中粉碎成粉末狀，稱取蛹蟲草粉末10.00 g，用95%的乙醇浸提3次后，將子實(shí)體晾干，揮發(fā)掉殘存的乙醇溶劑，備用。用熱水浸提法提取粗多糖，以除脂后的子實(shí)體干粉為材料，用熱水提取子實(shí)體粗多糖，溫度80℃，提取時(shí)間2 h，料液比1∶10，4層紗布過濾，濾液用濃度75%的乙醇沉淀，于4℃冰箱中放置12 h，3 000 r/min離心15 min，所得沉淀物經(jīng)丙醇、無水乙醇洗滌后真空干燥，即為粗多糖，稱重［5］;②蟲草素含量的測(cè)定:將蛹蟲草子實(shí)體切成小塊，置于烘箱內(nèi)，40℃條件下烘干數(shù)小時(shí)，直至完全干燥。將干燥后的子實(shí)體小塊放入電動(dòng)粉碎機(jī)中粉碎成粉末狀。稱取蛹蟲草粉末5.00 g，加入25 mL 70%的乙醇，浸提8 h，震蕩2 h，過濾，收集濾液。重復(fù)3次，合并濾液，真空干燥后，用5 mL的超純水溶解，過濾后備用。采用高效液相法(HPLC)測(cè)定蟲草素含量［6］:高效液相色譜儀:waters 1525 Binary HPLC Pump;檢測(cè)器:waters2487 Dualλabsorbance Detector;流動(dòng)相:甲醇∶超純水=15∶85;檢測(cè)波長:260 nm;流速:0.8 mL/min;保留時(shí)間:9.2 min。蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=2E+08x+648 346，r=0.999 4

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株菌絲生長試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，各菌株的菌絲在生長初期都十分緩慢，顯示菌絲處于適應(yīng)期，然后發(fā)現(xiàn)菌絲生長總勢(shì)明顯加快。總體來看，6號(hào)菌絲生長最快，菌落整齊，形態(tài)正常，轉(zhuǎn)色比較好。其它的菌株都比6號(hào)菌株萌發(fā)遲緩、長勢(shì)差，1號(hào)生長最為緩慢，長勢(shì)最差，轉(zhuǎn)色慢。

表1 不同菌株菌絲生長試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Test results of different strains on mycelium growth

2.2 不同菌株液體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液體培養(yǎng)生物量的測(cè)定搖瓶培養(yǎng)7 d后，發(fā)現(xiàn)6號(hào)菌株的液體培養(yǎng)基透明，其中的菌球大小適當(dāng)、均勻一致、豐富，菌絲球表面形成大量放射狀的菌刺;1號(hào)菌株的培養(yǎng)基透明，但是菌球量較少。不同菌株的生物量試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可知，6號(hào)菌株菌絲累積量最多，達(dá)到1.39 g/100 mL。說明6號(hào)菌株的液體培養(yǎng)中能累積大量的菌絲體，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有實(shí)際的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

圖1 不同菌株菌絲體生物量試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Test results of different strains on mycelium biomass

2.2.2 液體培養(yǎng)胞外多糖含量的測(cè)定搖瓶培養(yǎng)7 d，過濾，收集濾液，用苯酚-硫酸法測(cè)定不同菌株的胞外多糖含量，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知，6號(hào)菌株含量最高，可達(dá)到22.96 mg/mL。

圖2 不同菌株菌絲體胞外多糖試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Test results of different strains on Exocellular polysaccharide

2.3 不同菌株的瓶栽試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同菌株子實(shí)體形態(tài)描述菌株1號(hào)子實(shí)體橙黃色，柄矮、粗，頭部膨大呈球形，有子囊殼，部分頭部發(fā)白;菌株2號(hào)子實(shí)體橘黃色，柄彎曲、較細(xì)，有子囊殼，長勢(shì)密集;菌株6號(hào)子囊殼豐富，顏色橘黃，出草整齊均勻，出草率高，柄粗細(xì)均勻，出草疏密度適當(dāng);菌株B1子實(shí)體橘黃色，柄細(xì)、彎曲，小尖頭;菌株K36子實(shí)體橙黃色，柄細(xì)、光滑，根部粗(圖3)。

圖3 不同菌株人工栽培的子實(shí)體形態(tài)Fig.3 The fruitbody morphology of different strains on artificial cultivation

2.3.2 不同菌株人工栽培試驗(yàn)結(jié)果接入液體菌種后置發(fā)菌室18℃黑暗發(fā)菌，發(fā)菌時(shí)，菌絲雪白，絮狀，較稀疏，發(fā)菌結(jié)束時(shí)，菌絲能覆蓋整個(gè)料面并吃透培養(yǎng)料。7 d后待菌絲長滿培養(yǎng)料后進(jìn)行22℃光照轉(zhuǎn)色。轉(zhuǎn)色第3天，料面形成米黃色斑點(diǎn)，并且面積逐步擴(kuò)大;轉(zhuǎn)色約6 d時(shí)菌絲吐水并在料面形成水珠，同時(shí)開始漸漸形成草基;7 d后完成轉(zhuǎn)色，在塑料封口膜上打孔進(jìn)行出草管理，連續(xù)光照并定時(shí)噴水保濕，48 d后采草。隨機(jī)取10瓶蛹蟲草進(jìn)行樣品處理，稱其鮮草重量算得其生物轉(zhuǎn)化率，60℃烘干后，計(jì)算出每瓶的平均干重和鮮干比，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，6號(hào)菌株的平均干重和鮮干比都高于其他菌株，說明6號(hào)菌株的產(chǎn)量高，適合工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。

表2 不同菌株人工栽培試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test results of different strains on artificial cultivation

2.4 不同菌株子實(shí)體活性物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

提取并測(cè)定蟲草多糖和蟲草素的含量，作為篩選優(yōu)良菌株的所含活性物質(zhì)的指標(biāo)之一。不同菌株子實(shí)體多糖和蟲草素的提取測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知，6號(hào)的粗多糖和蟲草素含量均高于其他菌株，粗多糖含量比相同條件下提取的1號(hào)菌株高17.0%，蟲草素含量比相同條件下的K36菌株高41.3%。

表3 不同菌株子實(shí)體多糖和蟲草素的試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test results of different strains on fruitbody polysaccharide and cordycepin

3 結(jié)論

通過對(duì)不同蛹蟲草菌株的菌絲生長狀態(tài)的觀察和速度的測(cè)定、液體培養(yǎng)生物量積累的測(cè)定、人工栽培的子實(shí)體形態(tài)的觀察和生物轉(zhuǎn)換量的測(cè)定以及對(duì)子實(shí)體中活性物質(zhì)蟲草多糖和蟲草素的提取和檢測(cè)，從5株蛹蟲草中篩選出6號(hào)菌株，其菌絲萌發(fā)快、長勢(shì)好，液體培養(yǎng)生物量積累量高，子實(shí)體形態(tài)優(yōu)良、產(chǎn)量高，子實(shí)體中所含活性物質(zhì)蟲草多糖和蟲草素的量均高于其他菌株。所以，基于6號(hào)的這些特點(diǎn)，說明6號(hào)可以作為生產(chǎn)用的液體菌種，是值得人工栽培、研究開發(fā)和推廣的好品種。

［1］ 楊志超，楊?yuàn)檴?食藥用菌生產(chǎn)與消費(fèi)指南［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1997:289-295.

［2］ 張甲生，馬如冰，何玲，等.蠶蛹蟲草和冬蟲夏草中無機(jī)元素的比較［J］.中國食用菌，1991，10(2):43-44.

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