不同毒力瘧原蟲(chóng)感染早期根治性治療對(duì)免疫記憶形成影響的研究

劉英杰，李瑩，潘艷艷，朱曉彤，劉軍，單風(fēng)平，曹雅明*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001)

瘧疾流行的顯著特征是反復(fù)感染普遍存在。目前全球流行的瘧疾主要由惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)感染所致，其中前者毒力較強(qiáng)，并且再感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也明顯高于后者［1］。持久性免疫記憶的建立可抵御再感染的發(fā)生或可減少再感染后的蟲(chóng)荷水平［2］。間日瘧感染者痊愈后，其免疫記憶水平可恒定保持?jǐn)?shù)月［3］，并可對(duì)間日瘧原蟲(chóng)抗原產(chǎn)生明顯的應(yīng)答反應(yīng)，但惡性瘧感染者卻未能產(chǎn)生此應(yīng)答反應(yīng)［4］。這表明毒力不同蟲(chóng)株感染與免疫記憶形成以及再感染的發(fā)生存在密切相關(guān)性。但惡性瘧和間日瘧感染早期根治性治療后，其免疫記憶形成是否存在差異目前尚未見(jiàn)明確報(bào)道。致死型約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium yoelii 17XL，P.y 17XL)和非致死型約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium yoelii 17XNL，P.y17XNL)分別與惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)具有相似的生物學(xué)特性［5］。本研究對(duì)P.y17XL和P.y17XNL感染早期DBA/2小鼠進(jìn)行根治性治療，然后用同種瘧原蟲(chóng)進(jìn)行再感染，通過(guò)對(duì)再感染前后脾細(xì)胞中記憶性T、B細(xì)胞百分率檢測(cè)，以期明確毒力不同蟲(chóng)株感染早期根治性治療后的免疫記憶形成是否存在差異，并探討再感染能否進(jìn)一步促進(jìn)免疫記憶的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料6～8周齡雌性DBA/2小鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所;P.y17XL和P.y17XNL由日本愛(ài)媛大學(xué)分子寄生蟲(chóng)學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑氯喹和青蒿琥脂片分別購(gòu)自上海中西藥業(yè)有限公司和廣西桂林藥業(yè)有限公司;細(xì)胞熒光標(biāo)記抗體、HRP-羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a及底物均購(gòu)自BD Pharmigen。

1.2 方法

1.2.1 小鼠感染和治療及再感染小鼠經(jīng)腹腔分別接種P.y17XL和P.y17XNL(1×106)寄生的紅細(xì)胞，尾靜脈采血，觀察紅細(xì)胞感染率。初次感染后3 d，開(kāi)始經(jīng)口給藥(青蒿琥脂片60 mg/kg，氯喹90 mg/kg)，1次/d，連續(xù)3 d。初次感染后90 d，用同種瘧原蟲(chóng)再次感染小鼠。

1.2.2 脾細(xì)胞中記憶性T、B細(xì)胞百分率的檢測(cè)

無(wú)菌取出再感染前(0 d)和再感染后第1、3、5天小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)脾細(xì)胞終濃度為1×107/mL。在預(yù)先加入封閉抗體的染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 mL，然后在檢測(cè)記憶性T細(xì)胞染色管中依次加入FITC-conjugated anti-mouse CD4、APC-conjugated anti-mouse CD62L和PE-conjugated anti-mouse CD45RB;在檢測(cè)記憶性B細(xì)胞染色管中加入PerCP-conjugated anti-mouse B220和FITC-conjugated anti-mouse IgG，洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，Student’s-t檢驗(yàn)比較各組均值的顯著性差異，P＜0.05為差異顯著(結(jié)果為3次結(jié)果的均值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 再感染后不同時(shí)間的原蟲(chóng)血癥水平

如圖1所示，感染早期根治性治療的小鼠在再感染過(guò)程中僅出現(xiàn)了短暫的低水平蟲(chóng)體血癥。在再感染后每一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，不同毒力蟲(chóng)株的蟲(chóng)體血癥水平基本相似，并均于攻擊后第6天左右自愈;而未治療初次感染小鼠的蟲(chóng)體血癥水平持續(xù)升高，表明毒力不同瘧原蟲(chóng)初次感染早期根治性治療的小鼠對(duì)同種瘧原蟲(chóng)的再感染具有相似的抵抗力。

圖1 P.y17XL和P.y17XNL初次感染和再感染后的蟲(chóng)體血癥水平Fig.1 The levels of parasitemia after primary infectionand reinfection with P.y17XL and P.y17XNL

2.2 再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)脾T細(xì)胞中記憶性T細(xì)胞的百分率

如圖2所示，在再感染前，2種毒力不同蟲(chóng)株感染鼠脾T細(xì)胞中的記憶性T細(xì)胞百分率均略高于正常小鼠，與之相比，再感染后的記憶性T細(xì)胞百分率均明顯增加(*P＜0.05或＊＊P＜0.01);與相應(yīng)的再感染前小鼠相比，P.y17XL感染鼠的記憶性T細(xì)胞在再感染后第1天即出現(xiàn)了有意義的升高(☆P＜0.05)，而P.y17XNL感染鼠在再感染后第5天也出現(xiàn)了有意義的升高(☆P＜0.05)。這表明再感染前小鼠體內(nèi)存在少量的記憶性T細(xì)胞;再感染可促進(jìn)記憶性T細(xì)胞形成。但在每一相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，不同毒力蟲(chóng)株感染鼠的記憶性T細(xì)胞水平基本相似。

圖2 再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)脾T細(xì)胞中記憶性T細(xì)胞的百分率Fig.2 The percentage of memory T cell in spleen T cells from mice pre-and post-reinfection with P.y17XL and P.y17XNL at different time points

2.3 再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)脾細(xì)胞中記憶性B細(xì)胞的百分率

圖3 再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)脾細(xì)胞中記憶性B細(xì)胞的百分率Fig.3 The percentage of memory B cells in spleen cells from mice pre-and post-reinfection with P.y17XL and P.y17XNL at different time points

如圖3所示，再感染前小鼠脾細(xì)胞中記憶性B細(xì)胞的百分率略高于正常鼠;與正常鼠或再感染前小鼠相比，感染后第3、5天，2組小鼠記憶性B細(xì)胞百分率均明顯增加(＊＊P＜0.01;☆P＜0.05或☆☆P＜0.01);但在再感染后第5天出現(xiàn)不同程度的下降。在每一相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，不同毒力蟲(chóng)株感染鼠的記憶性B細(xì)胞水平大致相同。表明再感染前小鼠體內(nèi)存在少量的記憶性B細(xì)胞;再感染可促進(jìn)記憶性B細(xì)胞的形成，但高水平記憶性B細(xì)胞不能持續(xù)存在。

3 討論

有研究顯示，間日瘧感染者痊愈后，其免疫記憶可持續(xù)存在，并可對(duì)間日瘧原蟲(chóng)抗原產(chǎn)生明顯的應(yīng)答反應(yīng)，但惡性瘧感染者卻未能產(chǎn)生此應(yīng)答反應(yīng)［3-4］。提示毒力不同蟲(chóng)株感染與免疫記憶形成以及再感染的發(fā)生存在密切相關(guān)性。瘧原蟲(chóng)感染雖然可誘導(dǎo)記憶性T、B細(xì)胞產(chǎn)生［6-8］，但強(qiáng)毒株瘧原蟲(chóng)感染可抑制免疫記憶形成［9］。

本研究顯示，在再感染過(guò)程中，2組小鼠均出現(xiàn)了短暫的低水平蟲(chóng)體血癥。表明2組小鼠對(duì)同種瘧原蟲(chóng)的再感染具有相似的抵抗力。再感染前，2組小鼠脾細(xì)胞中記憶性T、B細(xì)胞水平相似，均略高于正常小鼠，提示感染早期根治性治療小鼠可產(chǎn)生少量免疫記憶T、B細(xì)胞。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，少量記憶性T、B細(xì)胞的存在，即使不能完全抵御再感染的發(fā)生，但也可明顯降低再感染的蟲(chóng)荷水平［6-8］，與本研究結(jié)果基本吻合。此外，本研究還顯示，再感染可進(jìn)一步促進(jìn)記憶性T、B細(xì)胞產(chǎn)生，但無(wú)論是再感染前或再感染后，2組小鼠記憶性T、B細(xì)胞的水平在相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均沒(méi)有顯著差異。可見(jiàn)，當(dāng)P.y17XL和P.y17XNL感染的紅細(xì)胞在外周血出現(xiàn)時(shí)即進(jìn)行根治性治療，可使小鼠受到相同蟲(chóng)荷的抗原刺激，同時(shí)也阻止了P.y17XL對(duì)免疫記憶形成的抑制作用，因此2組小鼠獲得了相似的免疫記憶和抵御再感染的能力。

綜上所述，不同毒力瘧原蟲(chóng)感染早期的根治性治療可使宿主產(chǎn)生水平相近的免疫記憶，再感染可促進(jìn)免疫記憶的形成，但再感染后第5天記憶性B細(xì)胞水平的明顯下降，是否可以解釋人類(lèi)不能對(duì)瘧疾感染產(chǎn)生消除性免疫尚有待進(jìn)一步證實(shí)。

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