類胡蘿卜素產生菌種的鑒定

劉卉琳，劉紹，2，蘭時樂，謝達平*

(1.湖南農業大學生物安全與技術學院，湖南長沙410128;2.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128;3.湖南農業大學生命科學技術學院，湖南長沙410128)

類胡蘿卜素是碳氫化合物及其氧化衍生物兩大類色素的總稱。它具有多種功能，從最原始的光合作用到抗氧化劑、維生素A的前體物質，它在化學、醫療以及食品和飼料添加劑上的重要價值普遍受到關注［1］。于人工生產而言，類胡蘿卜素主要通過化學合成法、植物提取法和微生物發酵法得到。化學合成法生產類胡蘿卜素存在一些缺點:合成技術復雜、影響食品的口味、人體吸收比例較少以及存在一定副作用［2-3］;植物提取法獲得類胡蘿卜素存在受季節限制、產量較低、成本較高的劣勢。因此，近年來，人們對微生物生產類胡蘿卜素進行了大量的研究。截止目前人類已經發現能夠產生類胡蘿卜素的微生物有細菌、藻類和真菌等。酵母菌的經典鑒定方法主要依賴其形態學和生理生化特征反應，但由于酵母菌屬種菌落形態相似，主要以單細胞形式存在，且細胞形狀接近，通過形態特征觀察依據不充分;菌落在長期培養或變異后產生新的突變株及同化碳源、氮源等化合物的能力，因此只靠生理生化特征作為種間鑒別依據也并不完全可靠［4-6］。隨著當代生命科學的發展，rRNA基因的序列分析被越來越多地應用于酵母菌的分類研究中。本研究通過定性分析，常規分類方法，按照形態學和生理生化特征將從福建紅酒酒糟中分離出的產類胡蘿卜素的菌株進行初步分類，結合分子分類學，利用26S rDNA D1/D2區域的堿基序列分析法對該菌株進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種從福建紅酒酒糟中分離出來的編號為B-5的產色素的菌株，由湖南農業大學生物科技學院微生物實驗室保藏。

1.1.2 培養基大米半合成培養基:大米8 g，水20 mL，葡萄糖0.2 g;麥芽汁培養基、馬鈴薯培養基、Gorodkowa培養基、葡萄糖發酵培養基、同化碳源培養基、硝酸鉀培養基、50%葡萄糖-酵母膏瓊脂培養基、產類淀粉化合物培養基等的配制參照文獻［7］進行。

1.2 方法

1.2.1 色素的鑒定挑取活化菌株，接種于大米半合成培養基上，28℃下培養3 d，將發酵產物干燥后稱取1 g，加入丙酮20 mL，于超聲波下破碎1 h，離心取上清液即得色素粗提液。將初提液進行波長掃描，并參照文獻［8］進行鑒定。

1.2.2 形態學特征鑒定參照文獻［7］進行鑒定。①細胞形態學觀察:取待鑒定菌株接種培養，轉接至麥芽汁培養基中，28℃下培養3 d，鏡檢，觀察細胞形態和無性繁殖方式;②培養特征:取待鑒定菌株接種培養，轉接至麥芽汁培養基和5%麥芽汁固體平板上，28℃下培養3 d，觀察液體培養液是否有浮膜、環及沉淀物。固態培養基中觀察菌落色澤、質地、表面是否有褶皺及邊緣形狀;③子囊孢子的形成和形態:取待鑒定菌株接種培養，轉接至馬鈴薯培養基和Gorodkowa培養基，28℃培養3～5 d，涂片觀察子囊孢子形態及孢子數;④假菌絲的形成和形態:取待鑒定菌株接種培養，用新鮮培養物劃線接種至馬鈴薯培養基，蓋上滅菌蓋片，28℃培養3～5 d，低倍鏡觀察蓋片下劃線兩旁是否形成假菌絲。

1.2.3 生理生化特征鑒定參照文獻［7］進行鑒定。①葡萄糖發酵試驗:取葡萄糖發酵培養基，接入培養好的菌液1 mL，28℃下培養，7 d內杜氏管內如有產氣現象，認為可以發酵葡萄糖;②碳源同化試驗:生長圖譜法［9］;③氮源同化試驗:分別接種新鮮培養物于0.78%硝酸鉀的培養基內，28℃培養2 d，觀察是否同化硝酸鉀情況;④耐高滲透壓試驗:取新鮮培養物接種至50%葡萄糖-1%酵母膏溶液的瓊脂培養基中，28℃培養1～2周，觀察菌種生長情況;⑤產類淀粉化合物試驗:在產類淀粉化合物培養基上劃線接入待鑒定菌株，28℃培養1～2周，表面滴盧氏碘液1滴，觀察菌落情況，如菌落周圍呈現藍色，即為“+”;⑥37℃生長試驗:取待鑒定菌株接種至麥芽汁培養基中，37℃培養3～5 d，觀察菌種生長情況。

1.2.4 分子生物學鑒定①酵母總DNA的提取:參照文獻［10］進行提取;②PCR引物的設計與擴增［6］:根據酵母基因組26S rDNA D1/D2區序列設計一對簡并特異引物:NL-1/NL-4，由上海Invitrogen生物公司合成。正向引物NL-1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物NL-4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。PCR反應條件:94℃預變性3 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，30次循環;4℃保存;③PCR產物的測序:將PCR擴增的目的片段回收、純化，產物送上海英駿生物技術公司測序，將測序結果輸入www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST軟件，將測得的基因序列與GenBank數據庫的序列進行同源性比較。

2 結果與分析

2.1 色素鑒定

色素粗提液經掃描得到最大吸收峰在波長450 nm左右。色素的乙醚溶液加入濃硫酸后，發生藍綠色反應，色素在吸收光譜和化學性質上與類胡蘿卜素相符，該色素為類胡蘿卜素。

2.2 形態學特征

待測菌株為單細胞，呈卵圓形，芽殖;在液體培養基中，1 d左右出現混濁，隨著時間增加，有沉淀產生;在固體培養基上，菌落呈深紅色，菌落表面濕潤、粘稠，邊緣整齊，易被挑起;無子囊孢子;無假菌絲形成。

圖1 B-5菌株形態圖Fig.1 The morphological characteristic of the B-5 strain

2.3 生理生化特征

為進一步鑒定該菌株所屬類型，進行生理生化鑒定試驗。葡萄糖發酵試驗結果為陰性，說明該菌株不能發酵葡萄糖。碳源同化試驗結果見表1。氮源同化試驗結果為陽性，說明該菌株能同化硝酸鉀。耐高滲試驗結果為陰性。產類淀粉化合物試驗結果為陰性。37℃生長試驗結果為陽性。結合形態學特征與6種生理生化特征分析，對照酵母菌鑒定手冊，結果表明，該菌株屬于紅酵母屬(Rhodotorula)。

2.4 26SrDNA鑒定結果

將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，供試酵母可擴增出1條600 bp左右的特異條帶。將PCR產物測序結果輸入NCBI網站進行同源性比對分析，GenBank登錄號:EU285542，26S rDNA的D1/D2區域序列比對結果表明待測酵母菌與粘性紅圓酵母(Rhodotorula mucilaginosa)完全一致，說明待測酵母菌為粘性紅圓酵母。

表1 碳源同化試驗結果Table 1 The results of sugar sources assimilation test

圖2 B-5菌株的PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR product of the B-5 strain

3 討論

從福建酒糟中分離的菌株所產色素為類胡蘿卜素。據形態特征與生理生化鑒定結果可知，該產色菌株屬于紅酵母屬，進一步進行分子鑒定，26S rDNA的D1/D2區域序列比對結果表明待測酵母菌與粘性紅圓酵母(Rhodotorula mucilaginosa)完全一致，說明該菌株為紅酵母屬粘性紅圓酵母。該酵母來源于酒糟，屬于食品加工中安全菌種，可作為類胡蘿卜素生產菌株選育的出發菌株。國內外關于粘性紅圓酵母產類胡蘿卜素的報道不多，因此為進一步研究粘性紅圓酵母的誘變、改良和提高其類胡蘿卜素產率具有一定的價值。

［1］ Ginka I.，Frengova，Dora M.，et al.Carotenoids from Rhodotorula and Phaffia:yeasts of biotechnological importance［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36:163-180.

［2］ Prabhala R.H.，Braune L.M.，Garewal H.S.，et al.Influence of β-carotene on Immune Functions［J］.Ann N Y Academic Sci，1993，691:48-60.

［3］ Kornhauser A.，Wamer W.，Krinsky N.I.，et al.Carotenoid:Chemistry and Biology［M］.Plenum Press，New York，1990:301-312.

［4］ Buckley H.R.，Van Uden N.Five New Candida Species［J］.Mycopathologia，1968，36:257-266.

［5］ Kurtzman C.P.，Fell J.W.The Yeasts，a Taxorromic Study［J］.Mycopathologia，2000，149:157-158.

［6］ 白逢彥，賈建華，梁慧燕.假絲酵母屬疑難菌株大亞基rDNA D1/D2區域序列分析及其分類學意義［J］.菌物系統，2002，21(1):27-32.

［7］ 巴尼特J.A.，佩恩R.W.，亞羅D.，胡瑞卿譯.酵母菌的特征與鑒定手冊［M］.青島:青島海洋大學出版社，1991.

［8］ 郝常明，王德培，丁友昉.光合細菌中類胡蘿卜素的提取及性質的研究［J］.天津輕工業學報，1999，(3):5-11.

［9］ 周德慶.微生物學實驗手冊［M］.上海:上海科學技術出版社，1986.

［10］ Hoffman C.S.，Winston F.A Ten-minute DNA Preparation from Yeast Efficiently Releases Autonomous Plasmids for Transformation of Escherichia coli.［J］.Gene，1987，57:267-272.