玉米漿對Vc二步發酵產2-酮基-L-古龍酸影響的研究

牛建雙，呂淑霞，趙朔，林英，馬鏑，劉鵬舉

(沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧沈陽110866)

維生素C，又名L-抗壞血酸，是人體營養所必需的水溶性維生素［1］。尹光琳等［2］發明了Vc二步發酵法，主要利用氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)俗稱小菌和巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)俗稱大菌混合菌體系，將L-山梨糖轉化為Vc的前體2-酮基-L-古龍酸(2-Keto-L-gulonic acid，2-KLG)，并應用于Vc的工業生產。目前對混合菌發酵體系中大、小菌關系比較明確的認識是:大菌單獨培養容易，本身不產酸;小菌可將L-山梨糖轉化為Vc前體2-KGA［3］，小菌單獨培養不產酸，單獨培養傳代存活率及產2-KLG能力均較低［4］，但是大、小菌的確切作用機制尚不清楚，對此方面研究也相對較少［5］。前人多從大菌分泌的胞外活性物質入手，研究大、小菌的關系，操作較復雜。玉米漿是發酵培養基的成分之一，以玉米制淀粉或制糖中的玉米浸泡水制得［6］，其構成成分較復雜。玉米漿中富含大量的糖類、可溶性蛋白質、氨基酸、多肽、脂肪酸、維生素、肌醇、水解酶、其他有機化合物、重金屬和無機離子。由于富含可溶性蛋白和多種游離氨基酸，是微生物發酵的良好氮源［7］。王紹萍等［8］經高效液相色譜檢出玉米漿中含有谷氨酸等12種氨基酸。目前，在Vc二步發酵研究中，玉米漿作為發酵培養基的成分之一，和其他成分一起進行濕熱滅菌，還未有報道將其用0.22 μm濾膜過濾除菌后再加入滅過菌的其他培養基成分。過濾除菌避免了濕熱滅菌的弊端，可以使玉米漿中的活性物質不被高溫高壓破壞。本文拋開大菌，從培養基成分玉米漿入手，添加不同量的過濾除菌玉米漿，初步研究其對小菌產酸及生長的影響，初步研究了玉米漿中主要的12種氨基酸對小菌產酸的影響，為Vc二步發酵法的研究提供了一個新的切入點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種氧化葡萄糖酸桿菌(G.oxydans)，由東北制藥總廠提供。

1.1.2 培養基①種子培養基(%):山梨糖2.0，葡萄糖0.2，尿素0.1，玉米漿0.5，碳酸鈣0.1;②發酵培養基(%):山梨糖8.0，尿素1.2，KH2PO40.1，MgSO40.02，10×10－6FeSO40.1 mL/L，碳酸鈣0.5。各種培養基均以30%NaOH調節pH為6.7～7.0，121℃滅菌30 min［9］。

1.2 方法

1.2.1 培養方法種子培養和發酵分別在28℃，180 r/min振蕩培養24 h和72 h［10］。

1.2.2 玉米漿的過濾除菌分別取1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 g玉米漿溶于20 mL蒸餾水，30%NaOH調節pH為6.7～7.0，8 000 r/min離心5 min，取上清，以0.22 μm濾膜過濾除菌，分別與滅好菌的發酵培養基其他成分混合。

1.2.3 2-酮基-L-古龍酸含量測定吸取2 mL發酵液樣品于試管中，加入2 mL 7 mol/L濃H2SO4搖勻。100℃沸水浴中煮沸30 min，自來水冷卻后加入250 mL三角瓶中，以1%淀粉溶液作指示劑(用量約為3 mL/100 mL)，用0.05 mol/L的I2溶液滴定至藍色為反應終點。按如下公式計算2-KGA的生成量。

M為I2溶液濃度(0.05 mol/L×2);V為0.05 mol/L I2溶液消耗的體積(mL);A為2-KLG轉化為Vc的轉化率(%)(以63.10%計算);B為所取發酵液毫升數(2 mL);0.907 2為Vc分子量/2-KLG分子量;0.088 06為每毫升0.05 mol/L碘液相當8.806 mg Vc［11］。

1.2.4 小菌活菌數測定平板菌落計數法計算活菌數，將發酵液稀釋至10－7～10－9，然后取0.1 mL均勻涂布在分離培養基上，48 h后計算活菌數［12］。

2 結果與分析

2.1 玉米漿含量對小菌發酵的影響

按照10%接種量將小菌種子接入不同玉米漿含量發酵培養基中，29℃，180 r/min搖床培養72 h。碘量法測定2-KLG含量，并檢測發酵液中小菌活菌數，結果見表1。從表1可以看出，玉米漿含量2.5 g/100 mL左右時，2-KLG產量達最大值，為26.84 mg/mL，發酵液中小菌活菌數達到8.18×109cfu/mL，為不添加過濾除菌玉米漿時小菌單菌發酵下的9.74倍。玉米漿濃度增加到3 g/100 mL時，2-KLG產量開始下降。培養體系營養增加，利于菌體生長繁殖，使發酵液中菌體濃度增加，產酸量增加。但加入玉米漿過多時，菌體生長過于旺盛，使得用于產生菌體的山梨糖用量增加，使產酸量下降。因此玉米漿的添加量為2.5 g/100 mL。

表1 發酵培養基中玉米漿添加量對產酸菌的影響Table 1 Effects of corn steep liquor content in fermentation medium on G.oxydans

2.2 玉米漿中氨基酸對小菌發酵的影響

未含玉米漿成分的發酵培養基中氨基酸加入量為0.5 g/L和2.0 g/L。表2為添加12種氨基酸對小菌發酵產酸影響。從表2可以看出，12種氨基酸分別與小菌培養，及混合后與小菌培養，都不能促進小菌產酸及生長。玉米漿中還含有多種維生素等生長因子，這些維生素等作為生長因子對微生物發酵也會產生影響。玉米漿中其他成分對小菌產酸的影響還待研究。

表2 發酵培養基中氨基酸對產酸菌的影響Table 2 Effects of Amino acid in fermentation medium on G.oxydans

3 結論

Vc二步發酵培養基中過濾除菌玉米漿的加入影響了小菌單獨發酵產2-KLG的量以及小菌活菌數。當加入玉米漿含量提高時，小菌發酵產2-KLG量提高，小菌活菌數增多。當加入玉米漿為2.5 g/100 mL左右時，產酸量最高是小菌單獨發酵產酸的10.48倍，菌體含量是不添加玉米漿時小菌單菌發酵下的9.74倍。隨玉米漿加入的提高，菌體數量生長消耗山梨糖增加，產酸量下降。所以發酵過程選擇最適玉米漿含量為2.5 g/100 mL。玉米漿成分中12種氨基酸的加入未對小菌產酸產生促進作用。玉米漿中其他成分對小菌產酸的促進作用還有待進一步研究。由于玉米漿生產成本低，又可對Vc二步發酵中小菌產酸及生長起到顯著促進作用，所以玉米漿對小菌產酸的促進作用值得進一步研究，這為Vc二步發酵中大小菌伴生機制研究提供了一個新的切入點。

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