一多重耐藥單增李斯特菌株的生長特性及毒力分析

邵美麗，許巖，趙燕麗，李建斌，劉春陽

(東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030)

單增李斯特菌(Listeria monocytogenes，L.M.)作為國際公認的四大食源性致病菌之一，在食品中具有較高的污染率，自2000年以來，我國上海、浙江、廣東、廣西、深圳等部分省市統計表明，肉類食品中該菌的污染率已達16%左右［1-3］。且由于抗生素在食源性動物中的廣泛使用，導致該致病菌表現出多重耐藥的發展趨勢，這給食品安全管理及該病的防治工作帶來巨大隱患。因此，單增李斯特菌已成為各級食品安全部門重點監管監測的對象之一。2008年，本課題組開展了哈市生肉中單增李斯特菌的污染狀況調查及其耐藥性分析這一研究課題。期間，課題組分離到1株特殊的單增李斯特菌。該菌株不僅具有超強的耐藥性(17種抗生素耐受)，同時其單個菌落明顯大于其他標準菌株。為詳細了解該多重耐藥菌株的其他生物學特征，為其耐藥性與生物學特征相關性的探討奠定基礎，本課題組進一步對該多重耐藥菌株的生長及其毒力特性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株標準菌:L.M.54006;試驗菌:L.M.B8(從生肉中分離得到)。

1.1.2 動物及飼養清潔級昆明小白鼠購自哈爾濱醫科大學，于溫度22～25℃，濕度45%～55%的環境中飼養，自由攝食、飲水，飼養觀察1周后用于試驗。

1.1.3 培養基TSA-YE固體培養基、TSB-YE液體培養基購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特菌的生長特性測定①液體菌種的制備:將L.M.B8和L.M.54006(標準菌株)按照1%的比例接種到TSB-YE液體培養基中，35℃，180 r/min條件下振蕩培養至菌液OD600達到0.4～0.5后作為菌種備用;②NaCl對單增李斯特菌生長的影響:取L.M.B8和L.M.54006液體菌種各1 mL，分別接種到含NaCl(%)0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的100 mL TSBYE液體培養基(pH 7.2～7.4)，35℃，180 r/min條件下振蕩培養12 h，然后測定各NaCl含量下2菌株的OD600值。以NaCl含量(%)為橫坐標、OD600值為縱坐標，繪制曲線;③pH對單增李斯特菌生長的影響:取L.M.B8和L.M.54006液體菌種各1 mL，分別接種到pH為3、4、5、6、7、8、9、10的100 mL TSB-YE液體培養基(0.5%NaCl)，35℃，180 r/min條件下振蕩培養12 h，然后測定各pH條件下兩菌株的OD600值。以pH為橫坐標、OD600值為縱坐標，繪制曲線;④溫度對單增李斯特菌生長的影響:取L.M.B8和L.M.54006液體菌種各1 mL，分別接種到100 mL TSB-YE液體培養基中(pH 7.2～7.4、0.5%NaCl)，分別于5、10、15、20、25、30、35、40、45和50℃，180 r/min條件下振蕩培養12 h，然后測定各溫度條件下兩菌株的OD600值。以溫度為橫坐標、OD600值為縱坐標，繪制曲線;⑤單增李斯特菌生長曲線的測定:將L.M.B8和L.M.54006液體菌種各1 mL分別接種到100 mL TSB-YE液體培養基中(pH 7.2～7.4、0.5%NaCl)，在35℃，180 r/min條件下振蕩培養，分別在0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 h取樣，然后測定2菌株的OD600值。以培養時間為橫坐標、OD600值為縱坐標，繪制2菌株的生長曲線。

1.2.2 單增李斯特菌的半數致死量的測定清潔級昆明小白鼠110只，體重18～22 g，隨機分成11組，即L.M.B8設5個劑量組(按由低到高劑量，分別設為第1組、第2組、第3組、第4組、第5組)、L.M.54006設5個劑量組(按由低到高劑量，分別設為第6組、第7組、第8組、第9組、第10組)和1個對照組(設為第11組)，每組10只，雌雄各半。參照簡化寇氏法［4］，首先進行預實驗，確定死亡率在0～100%的劑量范圍為1.6×105～108cfu/mL，相鄰2組的劑量比為5。然后進行正式試驗，染毒途徑為腹腔注射，染毒劑量為0.1 mL/20 g，L.M.B8和L.M.54006的5個劑量組的染毒劑量分別為1.6×105、8×105、4×106、2×107和108cfu/mL。對照組注射等體積的生理鹽水。染毒后，連續觀察7 d，記錄各組動物死亡情況。將試驗結果代入計算公式，求出LD50及其95%可信限。

2 結果

2.1 NaCl對單增李斯特菌生長的影響

試驗結果(圖1)表明，在NaCl濃度為0.5%～11%范圍內，隨著濃度的增加L.M.B8和L.M.54006培養液的OD600逐漸降低。在0.5%～8%濃度范圍內，二者培養液的OD600均高于0.5，說明在此NaCl濃度范圍內，兩菌株均能良好生長。但在0.5%～5%NaCl濃度范圍內，L.M.B8培養液OD600均明顯高于L.M.54006培養液OD600，而當NaCl濃度高于5%后，L.M.B8培養液的OD600降至與L.M.54006培養液OD600相似水平。且當NaCl濃度由3%增至5%時，L.M.B8培養液OD600下降了35.84%，明顯高于L.M.54006培養液OD60017.74%的下降幅度。

圖1 NaCl對單增李斯特菌生長的影響Fig.1 Influence of NaCl on growth of Listeria monocytogenes

2.2 pH對單增李斯特菌生長的影響

試驗結果(圖2)表明，二者最適pH值均為8.0。pH＜4.0時，L.M.B8和L.M.54006幾乎不生長。在pH范圍為4.0～10.0時，2菌株培養液的OD600隨著pH的增加而逐漸增大，當pH為8.0時，OD600增至最大，之后隨著pH增加而OD600逐漸降低。且在pH4.0～10.0范圍內，L.M.B8培養液OD600一直高于L.M.54006培養液OD600，說明L.M.B8在此pH范圍內的生長速度明顯高于L.M.54006。

圖2 pH對單增李斯特菌生長的影響Fig.2 Influence of pH on growth of Listeria monocytogenes

2.3 溫度對單增李斯特菌生長的影響

試驗結果(圖3)表明，L.M.B8和L.M.54006最適溫度值為35℃。L.M.54006在25～45℃范圍內有良好生長，在25～35℃范圍內，隨著溫度升高L.M.54006培養液OD600逐漸增大，至35℃時增值最大，而后隨著溫度增加，其OD600逐漸降低。L.M.B8則在20～45℃之間均有良好生長，其變化規律與L.M.54006相似，但其培養液OD600均明顯高于L.M.54006培養液OD600。當溫度高于45℃或低于15℃，2菌株的生長明顯受到抑制。

圖3 溫度對單增李斯特菌生長的影響Fig.3 Influence of temperature on growth of Listeria monocytogenes

2.4 單增李斯特菌生長曲線的測定

單增李斯特菌的生長曲線見圖4，L.M.B8的遲緩期為0～2 h，對數生長期為2～4 h，穩定期為4～6 h，衰亡期為6 h以后。而L.M.54006的遲緩期為0～3 h，對數生長期為3～6 h，穩定期為6～12 h，衰亡期為12 h以后。

圖4 單增李斯特菌的生長曲線Fig.4 Growth curve of Listeria monocytogenes

2.5 單增李斯特菌的半數致死量結果

具體結果見表1。半數致死量(LD50)按以下公式計算:LD50=log－1［Xm－i(∑p－0.5)］，式中:Xm為最大死亡率組劑量對數;i為相鄰劑量比值的對數;∑p為各組死亡率總和。將所得數據代入上式算得L.M.B8小鼠腹腔注射的LD50為4.68×105cfu/mL，L.M.54006小鼠腹腔注射LD50為1.09×106cfu/mL。

LD50的95%可信限(FL)按以下公式計算:log－1(log LD50±1.96×SX50)，式中SX50為logLD50的標準誤差。將所得數據代入上式算得L.M.B8小鼠腹腔注射LD50 95%可信限為1.66×105～1.32×106cfu/mL。L.M.54006小鼠腹腔注射LD50 95%可信限為4.37×105～2.75×106cfu/mL。

表1 小鼠腹腔注射單增李斯特菌后的死亡情況Table 1 The mortality of mice exposed to Listeria monocytogenes by intraperitoneal injection

3 討論

近年來，食源性致病菌對食品的廣泛污染導致食源性疾病的發病率在全球范圍內呈上升趨勢，加之食源性致病菌日趨嚴重的耐藥現象，給食源性疾病預防和治療帶來了巨大困難。隨著對細菌耐藥機制研究的不斷深入，人們發現細菌耐藥性的產生與細菌的其他生物學特性可能存在一定關聯，尤其對細菌的毒力可能產生一定的影響［5］。目前，國內外對此方面的報道不多，有關單增李斯特菌耐藥性與其生物學特性相關性的研究尚未見報道。

2008年，本研究室在對哈爾濱市售128份生肉樣品進行單增李斯特菌的污染狀況調查及耐藥性分析時，發現了1株耐藥性極強的菌株L.M.B8，該菌株對四環素、紅霉素、萬古霉素等17種抗生素耐受。不僅如此，試驗過程中發現，L.M.B8的菌落特征發生明顯變化，其菌落大小為其他標準菌株的2倍左右。為了進一步詳細了解L.M.B8的生長及毒力特性，課題組針對NaCl濃度、pH值、溫度對L.M.B8生長的影響及其生長曲線進行進一步研究，同時對該菌株的LD50進行了測定分析。結果發現，NaCl濃度、pH值及溫度對L.M.B8和L.M.54006的影響規律基本一致，且L.M.B8生長的最適鹽濃度、最適pH值及最適溫度均與L.M.54006相同，但在最適生長條件下其生長速度均明顯高于L.M.54006。不僅如此，在NaCl濃度為0.5%～5%、pH值為4.0～10.0及溫度為20～45℃范圍內，L.M.B8的生長速度均明顯高于L.M.54006。但在3%～5%NaCl濃度范圍內，隨著鹽濃度增大，L.M.B8培養液OD600下降幅度明顯大于L.M.54006，說明L.M.B8對高濃度鹽的敏感性高于L.M.54006。此外，L.M.B8在20～45℃之間均能良好生長，而L.M.54006只是在25～35℃范圍內才能良好生長，說明L.M.B8對溫度的適應范圍明顯寬于L.M.54006。從生長曲線看，二者有明顯區別，L.M.B8的對數生長期與穩定期均較L.M.54006提前2～3 h，同時L.M.B8的穩定期約為3 h，明顯短于L.M.54006 6 h左右的穩定期。從以上可以看出，L.M.B8的生長特性與標準菌株L.M.54006相比，確實發生了一定的變化，這種變化可能與該菌株的多重耐藥性有一定相關性，但此變化與王麗平［6］研究的誘導耐藥后的豬鏈球菌生長速度滯后于誘導耐藥前的生長速度這一結果明顯不同，原因可能與細菌種類及具體耐藥種類不同相關。

此外，L.M.B8和L.M.54006小鼠腹腔注射的LD50結果表明，L.M.B8 LD50為4.68×105cfu/mL，低于L.M.54006的LD50 1.09×106cfu/mL，說明L.M B8的毒力較L.M.54006有所增強。此結果與文獻報道的用甲硝唑誘導產生的脆弱擬桿菌耐藥菌的毒力有所增強的結果相似［7-9］，與王麗平［6］研究的豬鏈球菌耐藥菌株LD50值較標準菌株LD50值降低這一趨勢也相一致，但與2000年Anna等［10］報道的肺炎球菌耐青霉素菌株由于其PBPs發生變異導致細菌毒力下降的結果相反，這說明細菌耐藥性的產生可能會引發菌株的毒力變化，但這種變化有細菌種屬特異性。

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