左旋精氨酸上調(diào)約氏瘧原蟲感染DBA/2小鼠的抗體應答效應

孫曉丹，潘艷艷，劉軍，李瑩，馮輝，鄭麗，延娟，王各各，馮永輝，曹雅明*

(1.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，遼寧沈陽110001;2.中國醫(yī)科大學臨床醫(yī)藥學院基礎中心，遼寧沈陽110002)

瘧疾是由瘧原蟲感染引起的一種對人類健康危害最為嚴重的寄生原蟲感染性疾病，全世界每年約有3～5億瘧疾感染病例，近100萬兒童因其死亡［1］。因此，研制有效的瘧疾疫苗和抗瘧新藥是當今世界亟待解決的重點課題，而誘導宿主建立抗瘧保護性免疫應答相關機制的闡明是其重要前提。L-Arg作為免疫營養(yǎng)劑已受到越來越多的關注，在機體營養(yǎng)代謝與免疫調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用［2-4］，但L-Arg提高免疫機能的機制尚不完全明了。研究表明，嚴重的惡性瘧原蟲感染與低L-Arg密切相關。L-Arg補充能夠恢復印度尼西亞患有嚴重瘧疾的成人內(nèi)皮功能及促進NO的產(chǎn)生［5］。動物模型和人體研究的結(jié)果均已表明:CD4+T細胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染過程中發(fā)揮著至關重要的作用。在瘧疾感染過程中，以IFN-γ分泌增加為主的Th1型細胞免疫應答可顯著遏制原蟲的爆發(fā)性增殖，Th2型細胞能夠輔助B細胞產(chǎn)生特異性抗體，能夠有效地清除瘧原蟲，防止復發(fā)和再燃。然而，目前關于L-Arg在瘧疾免疫中對于抗體應答為主的Th2應答的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究利用成功建立的P.y17XL抵抗鼠瘧模型，觀察了L-Arg對P.y17XL感染小鼠抗體應答的影響，旨在探討L-Arg在P.y17XL感染中的作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料6～8周齡、雌性DBA/2小鼠由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供(許可證編號:SCXK京200420001);P.y17XL由日本愛媛大學分子寄生蟲學教研室惠贈。

1.1.2 主要試劑熒光抗體均購自BD Pharmigen公司(PE-anti-CD138(clone 281-2)、PerCP-anti-B220(clone RA3-6B2)、FITC-anti-IgG1(clone A85-1)、FITC-anti-IgG2a(clone R19-15));L-Arg購自Sigma公司(St.Louis，MO，USA);胞內(nèi)染色試劑盒(BD Pharmigen)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物感染DBA/2小鼠分別經(jīng)腹腔感染1×106個/0.1 mL P.y17XL寄生的紅細胞(pRBC)，感染不同時間，小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數(shù)紅細胞感染率，并每日觀察生存率。

1.2.2 動物分組與L-Arg處理DBA/2小鼠隨機分為2組:生理鹽水處理組(NC組)和L-Arg處理組(L-Arg組)，每組20只小鼠。各組分別于感染前7 d給予等體積生理鹽水或L-Arg(1.5 g/kg)。

1.2.3 流式細胞檢測脾細胞懸液中加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體。每份樣品用抗CD138-PE和抗B220-PerCP單抗進行表面染色，按試劑說明書所示，進行固定和透膜后，再加入抗IgG1-FITC或抗IgG2a-FITC單抗。離心去上清后，用0.5 mL細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測［6-7］。

1.2.4 統(tǒng)計學分析使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，標本采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠感染不同時間原蟲血癥及其生存率

如圖1所示，NC組小鼠感染后3 d原蟲血癥水平開始上升，感染后第8天出現(xiàn)高峰，隨后下降，感染第12天再次出現(xiàn)高峰，隨后下降直至痊愈。與此相比，L-Arg組小鼠原蟲血癥上升緩慢，沒有出現(xiàn)明顯的高峰，痊愈時間明顯縮短。

圖1 DBA/2小鼠感染后不同時間原蟲血癥水平Fig.1 The parasitemia in different time after infection in mice

2.2 小鼠感染不同時間CD138+B220+IgG1+細胞數(shù)量

如圖2所示，與NC組相比，L-Arg組小鼠于感染后第8天和第10天CD138+B220+IgG1+細胞數(shù)量均出現(xiàn)有意義的升高(P＜0.05)。

2.3 小鼠感染不同時間CD138+B220+IgG2a+細胞數(shù)量

如圖3所示，與NC組相比，L-Arg組小鼠于感染后第10天CD138+B220+IgG2a+細胞數(shù)量明顯增多(P＜0.05)。

圖2 小鼠感染后不同時間脾臟CD138+B220+IgG1+細胞Fig.2 Percentage of CD138+B220+IgG1+cells in splenocytes in different time after infection in mice

圖3 小鼠感染后不同時間脾臟CD138+B220+IgG2a+細胞Fig.3 Percentage of CD138+B220+IgG2a+cells in splenocytes in different time after infection in mice

3 討論

不斷積累的研究數(shù)據(jù)表明，有效地消除瘧疾感染有賴于早期Thl型免疫應答的建立，以及隨后適時地向Th2型免疫應答的活化。本研究通過對P.y17XL抵抗DBA/2小鼠進行L-Arg預處理，發(fā)現(xiàn)L-Arg在瘧疾感染后期明顯促進抗體產(chǎn)生，降低原蟲血癥水平，縮短自愈時間。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在P.y17XL感染過程中抵抗的DBA/2小鼠在感染后期通過Th2介導的抗體效應最終消除原蟲感染［8-9］。以IgG抗體為主的體液免疫應答在最終清除宿主體內(nèi)瘧原蟲和抵御再感染方面發(fā)揮重要作用，尤其是IgG2a的產(chǎn)生，能夠更加有效的清楚瘧原蟲。本研究發(fā)現(xiàn)，LArg在瘧疾感染中明顯促進小鼠漿細胞分泌IgG1和IgG2a。

綜上，L-Arg預處理可誘導DBA/2小鼠建立更加有效的抗體應答，明顯加速DBA/2感染小鼠清除瘧原蟲。

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