1株高產(chǎn)多糖紅曲霉菌株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

汪鵬榮，劉偉芬，陳文靜，蔣冬花，藍(lán)麗精

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004)

多糖是一類(lèi)由醛糖或酮糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，常是細(xì)胞表面信號(hào)識(shí)別、抗原抗體反應(yīng)、細(xì)胞間信息傳遞和感受的關(guān)鍵因子［1］，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等藥理作用［2］。自1970年日本千原羽田從香菇中分離出一種抗腫瘤的多糖后，科學(xué)界掀起了食用真菌多糖研究的熱潮。目前，已在國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用的真菌多糖主要有香菇多糖、云芝多糖、云芝糖肽、靈芝肽多糖、猴頭菌多糖、銀耳多糖等［3］。紅曲霉(Monascus spp.)是一類(lèi)十分重要的藥用真菌，系中藥紅曲的基原菌［4］，是一類(lèi)小型絲狀腐生真菌，屬子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)不整囊菌綱(Plectomycetes)散囊菌目(Eurotiales)紅曲科(Monascaceae)，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其功能性成分莫納卡林K(Monacolin K)、γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid，GABA)和紅曲色素進(jìn)行了廣泛而深入的研究，但對(duì)紅曲多糖的研究卻不多。本研究根據(jù)紅曲霉菌株的生長(zhǎng)特性及趙振鋒等［5］有關(guān)紅曲菌胞外多糖的測(cè)定方法，對(duì)市售紅曲米、紅腐乳中的紅曲霉菌株進(jìn)行分離純化，從中得到56株紅曲霉菌株，然后通過(guò)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)測(cè)定胞外多糖含量，最終篩選出1株高產(chǎn)胞外多糖的紅曲霉菌株并對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定，為進(jìn)一步發(fā)掘紅曲霉菌株生物資源做有益探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源以市售紅腐乳及采自浙江金華地區(qū)的紅曲米為材料分離純化紅曲霉菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g);査氏培養(yǎng)基(Cza)［6］:葡萄糖30 g，NaNO33 g，酵母提取物1 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH 6，121℃滅菌30 min;發(fā)酵培養(yǎng)基［7］:蔗糖40 g/L，酵母粉4.5 g/L，KH2PO4·3H2O 3.5 g/L，MgSO40.4 g/L，發(fā)酵液起始pH 5.0;CYA培養(yǎng)基［8］:蔗糖30 g，NaNO33 g，酵母提取物5 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 6.0;MEA培養(yǎng)基［8］:麥芽浸出粉20 g，蛋白胨1 g，葡萄糖2 g，瓊脂15 g，補(bǔ)水至1 000mL，pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 紅曲霉菌株的分離用接種針挑取小塊紅腐乳外皮(或研磨成粉狀的紅曲米)，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)多次劃線分離，直到產(chǎn)生早期為白色、后期為紅色或紫色的單菌落，再用PDA固體培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，將所獲菌株編號(hào)，置4℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 菌種活化傳代和發(fā)酵種子的培養(yǎng)［6］用PDA固體斜面培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化傳代，菌株每4周轉(zhuǎn)接1次;30℃培養(yǎng)5 d，再轉(zhuǎn)接到PDA固體平板上，30℃活化培養(yǎng)72 h后用作發(fā)酵種子。

1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)多糖菌株的初篩取活化培養(yǎng)72 h的紅曲霉菌餅接入PDA液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)36 h作為種子液，然后將種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為8%，250 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)液，180 r/min 30℃培養(yǎng)96 h，最后取發(fā)酵液分析檢測(cè)粗多糖的產(chǎn)量，進(jìn)行菌株篩選。

1.2.4 發(fā)酵液中多糖含量的測(cè)定［5］發(fā)酵濾液定容至100 mL，取發(fā)酵液15 mL加入60 mL無(wú)水乙醇中，5℃下靜置8 h過(guò)濾，沉淀在80℃烘干12 h至恒重，稱(chēng)量即為胞外粗多糖含量。

1.2.5 紅曲霉菌株的鑒定①形態(tài)學(xué)觀察:將篩選出的高產(chǎn)菌株分別接種到MEA和CYA培養(yǎng)基中，在25℃培養(yǎng)7、14和25 d，觀察記錄菌落特征，根據(jù)李鐘慶等［8］紅曲菌分種檢索表及參考郭紅珍等［9］的描述對(duì)高產(chǎn)多糖菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定;②生理生化特征測(cè)定:碳源利用實(shí)驗(yàn):不含糖的查氏培養(yǎng)基中分別加4%的果糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、番薯粉、可溶性淀粉、甘油，配制好培養(yǎng)基后滅菌接種，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后觀察結(jié)果;氮源利用試驗(yàn):不含NaNO3的查氏培養(yǎng)基中分別加入0.3%的硫酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、亞硝酸鈉，配制好培養(yǎng)基后滅菌接種，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后觀察結(jié)果;明膠水解試驗(yàn):用含有0.5%蛋白胨、15%明膠的培養(yǎng)基，調(diào)pH值為7.0，分裝于試管，滅菌。挑取孢子用穿刺法接種于試管中央，另取2支不接種作空白對(duì)照(因明膠培養(yǎng)基在20℃以上融化，故觀察時(shí)先將培養(yǎng)管在4℃冰箱中冷卻，待對(duì)照管已完全凝固后，再記錄結(jié)果)，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7、14 d。在20℃觀察菌的生長(zhǎng)情況和明膠是否液化，如明膠凝塊部分或全部變?yōu)榭闪魍ǖ囊后w，則明膠水解陽(yáng)性;如果菌已生長(zhǎng)，明膠未液化，但明膠表面菌落下出現(xiàn)凹陷小窩也是輕度水解，也可視為陽(yáng)性;③rDNA ITS序列分析:采用改良的CTAB法提取基因組DNA。用真菌通用引物對(duì)(ITS1/ITS4)對(duì)紅曲霉進(jìn)行rDNA ITS的PCR擴(kuò)增和測(cè)序。引物F:5'-ATT ACG CCA GCA TCC TTGC-3';引物R:5'-TTT ACA ACT CCC AAA CCCC-3'。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，56℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訢L Marker 2 000為分子量標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)儀上觀察并記錄結(jié)果。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序，將獲得的ITS序列在GenBank的核酸序列庫(kù)中進(jìn)行同源性序列分析，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知紅曲霉菌rDNA ITS序列進(jìn)行比較，確定紅曲霉的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉的分離純化

通過(guò)分離、純化和初步鑒定，共獲得56株紅曲霉菌株。

2.2 高產(chǎn)多糖紅曲霉菌株的篩選

將篩選出的56株紅曲霉菌株接入PDA液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)36 h，然后接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，發(fā)酵液用乙醇沉淀法測(cè)胞外多糖含量。測(cè)定結(jié)果表明:不同紅曲霉菌株產(chǎn)生多糖的能力存在顯著差異，部分紅曲霉菌株發(fā)酵液中多糖的產(chǎn)量見(jiàn)表1，其中多糖產(chǎn)量較高的菌株有M-5、M-6、M-10等，又以M-6菌株的產(chǎn)量最高達(dá)4.73 g/L。以M-6紅曲霉菌株為研究對(duì)象進(jìn)行菌種鑒定和生物學(xué)特征研究。

表1 10株紅曲霉菌株發(fā)酵液中多糖的產(chǎn)量Table 1 The polysaccharide production of ten monascus strains

2.3 高產(chǎn)多糖紅曲霉M-6菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征①菌落特征:在CYA上，25℃培養(yǎng)后7 d，菌落直徑22 mm，表面質(zhì)地叢轉(zhuǎn)毛狀，邊緣流蘇狀，菌落中心的顏色由初期的白色慢慢向粉紅色轉(zhuǎn)變，但是菌落四周由于菌絲在繼續(xù)生長(zhǎng)顏色仍是白色，同時(shí)可以看出從第7天起該菌株已經(jīng)開(kāi)始向培養(yǎng)基分泌色素物質(zhì)(圖1A);在MEA上，25℃培養(yǎng)后7 d，菌落直徑32 mm，平坦而稀疏，中間微微隆起，邊緣完整，外形呈圓形皮膜狀，菌絲體邊緣呈白色，中間漸呈粉紅色(圖1B);②顯微特征:菌絲直徑2～7 μm，具橫隔，分枝狀，含有色素顆粒(圖1C);閉囊殼呈橢球形，單生在類(lèi)似柄的菌絲上，直徑30～50 μm，里面充滿(mǎn)密集排列的孢子，子囊孢子卵形或者球形(圖1D);分生孢子有時(shí)著生在側(cè)梗上，但是往往著生在菌絲頂端，形狀為犁形，具有平截基部，成熟時(shí)為圓形(圖1E)。

2.3.2 生理生化特征①碳源利用:由表2可知，高產(chǎn)菌株M-6能較好地利用除甘油外的6種碳源，其中麥芽糖為其最適生長(zhǎng)碳源，而在甘油培養(yǎng)基中幾乎不生長(zhǎng);②氮源利用:由表2可知，高產(chǎn)多糖菌株M-6均能利用表中所列的5種氮源，但在有機(jī)氮源中較無(wú)機(jī)氮源中生長(zhǎng)的好，而且在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好;③明膠水解:高產(chǎn)多糖菌株M-6不能水解明膠，而據(jù)邢旺興［10］報(bào)道，紫色紅曲霉能夠水解明膠，因此可推斷菌株M-6屬于紅曲霉中其他種屬。

圖1 菌株M-6的菌落特征和顯微特征圖Fig.1 Morphological and Colony characteristics of the strain M-6

表2 菌株M-6的碳源、氮源利用結(jié)果Table 2 Results of carbon source and nitrogen source utilization of the strain M-6

2.3.3 rDNA ITS序列與分析用真菌通用引物ITS1/ITS4以菌株M-6基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為544 bp的片段(圖2)。將菌株M-6的ITS PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將該菌株的序列與GenBank中其他紅曲霉進(jìn)行比對(duì)和同源性分析。結(jié)果表明，該菌株與紅色紅曲霉(Monascus rubber)、紫色紅曲霉(Monascus purpureus)、叢毛紅曲霉(Monascus pilosus)、煙灰色紅曲霉(Monascus fumeus)的同源性都高達(dá)99%(部分比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3)。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖Fig.2 The electrophoresis of PCR amplification products

表3 菌株M-6的BLAST相似度比對(duì)結(jié)果Table 3 Results of sequence similarity alignment in BLAST for the strain M-6

結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征，最終將高產(chǎn)多糖菌株M-6鑒定為紅色紅曲霉(Monascus rubber)。

3 討論

從紅腐乳和紅曲米中分離得到56株紅曲霉菌株，通過(guò)搖瓶發(fā)酵、乙醇沉淀法最終篩選出1株產(chǎn)量為4.73 g/L的高產(chǎn)多糖菌株M-6，依據(jù)李鐘慶等［8］的紅曲菌屬分類(lèi)檢索表及郭紅珍等［9］有關(guān)紅曲霉菌株分類(lèi)鑒定的描述，初步鑒定高產(chǎn)菌株M-6為紅色紅曲霉。氮、碳是構(gòu)成微生物細(xì)胞最重要的元素，利用氮源、碳源和明膠水解的能力是微生物生理上的一個(gè)重要特征，在微生物分類(lèi)上占有重要地位［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)高產(chǎn)多糖菌株M-6的部分生理生化特征進(jìn)行了研究，結(jié)果表明其最適碳源為麥芽糖，最適氮源為酵母粉，并且不能使明膠水解，故可排除其為紫色紅曲霉的可能性。由于紅曲菌的培養(yǎng)特征如菌落顏色、形態(tài)、大小等特性也都會(huì)發(fā)生一定的變化，給分類(lèi)帶來(lái)了很大的不確定因素［11］，為了進(jìn)一步確認(rèn)高產(chǎn)菌株M-6的分類(lèi)地位，利用ITS序列分析，并在GeneBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，最終確定高產(chǎn)菌株M-6為紅色紅曲霉(Monascus rubber)。

真菌多糖在免疫功能的調(diào)節(jié)、癌癥的診斷與治療、抗衰老及解除機(jī)體疲勞等方面都有著重要的作用，且得到大量國(guó)內(nèi)外科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)［12］。隨著科研人員對(duì)真菌多糖功效的更深層次了解，真菌多糖將被應(yīng)用于更多領(lǐng)域，尤其是制藥及保健品行業(yè)。利用浙江省紅曲資源分離篩選新功能的紅曲霉菌株，生產(chǎn)多糖功能性食品配料，也是一種新的嘗試，有利于微生物功能性食品和藥物資源的開(kāi)發(fā)利用，具有一定的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

［1］ Bohn J A，BeMiller J N.(1→3)-β-D-Glucans as biological response modifiers［J］.Carbohyd Polymers，1995，28(1):328.

［2］ Chen Zhen，Guo Qinglong，Gao Xiangdong，et al.Tumor inhibitory effect of YCP(a marine fugal polysaccharide)(I)［J］.Chin J Nat Med，2005，3(6):396-400.

［3］ 王舒寧.真菌多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2009，31(3):14-16.

［4］ Kohama Y，Matsumoto S，Mimura T，et al.Isolation and identification of hypotensive principles in red-mold rice［J］.Chem Pharm Bull，1987，35(6):2484-2489.

［5］ 趙振鋒，方惠英，諸葛健.紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖工藝的優(yōu)化［J］.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，2(3):289-295.

［6］ 李霞姣，夏永軍，王鐵軍，等.紅曲多糖液態(tài)發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化［J］.生物加工過(guò)程，2009，7(2):13-17.

［7］ LI Zhongqing，GUO Fang.A further studies on the species of Monsacus［J］.Mycosystema，2004，23(1):1-6.

［8］ 蔣冬花，后家衡，李杰，等.紅腐乳中高產(chǎn)γ-氨基丁酸紅曲霉菌株的篩選［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，30(4):447-452.

［9］ 郭紅珍.山西老陳醋大曲紅曲霉分離鑒定及生物學(xué)特性研究［D］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2004.

［10］ 邢旺興，程榮珍，宓鶴鳴，等.幾種常見(jiàn)紅曲霉的生理學(xué)特性研究［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2001，19(4):231-233.

［11］ 葉硯，蔣冬花，繆存影.紅曲米和紅腐乳中紅曲菌種的分類(lèi)與鑒定［J］.工業(yè)微生物，2009，39(6):38-44.

［12］ 朱建華，楊曉泉.真菌多糖研究進(jìn)展、結(jié)構(gòu)、特性及制備方法［J］.中國(guó)食品添加劑，2005，6:75-79.