環境pH誘導出芽短梗霉細胞多形化

孔維甲，徐瓊，靳建忠，王慧娟，李炳學

(沈陽農業大學土地與環境學院，遼寧沈陽110866)

環境pH值是影響微生物生長繁殖、生理代謝的重要因素，每種微生物都有特定的適宜生長的pH值范圍和最適宜生長pH值。在自然條件下，微生物所處生態位的pH值經常處于動態變化過程中。對于直接和環境接觸的單細胞微生物來說，適應環境pH值變化就顯得尤其重要。某些酵母狀真菌(如假絲酵母和白色念珠菌)在進化過程中，形成了酵母狀細胞和菌絲之間相互轉變的兩形性細胞轉變現象。這種細胞形態轉變的現象也受到全局調控因子調控，在不同環境pH值表現出不同的細胞轉變規律，形成更適合特定環境的細胞類型［1］。在環境pH不利于細胞生長繁殖時，酵母狀細胞轉變成假菌絲，尋找新的適宜環境;在遇到適宜生長pH值時，假菌絲可以出芽繁殖產生更多后代，有利于物種繁衍［2］。研究真菌細胞形態轉變與適應環境酸堿度變化的關系具有重要的科學意義。在真菌中，還存在多形態細胞轉變現象。常被稱作“黑酵母”的出芽短梗霉，具有典型的細胞多形性:酵母狀細胞，膨大細胞，厚垣孢子和菌絲［3-4］。酵母狀細胞和菌絲之間的兩形性轉變曾經受到關注［5］。但是，一直沒有關于出芽短梗霉多形性細胞轉變規律的報道。本研究組在前期研究發現，環境pH值對出芽短梗霉菌株Aureobasidium pullulans NG多形性細胞選擇轉變途徑影響顯著［6］。為驗證不同菌株是否具有響應環境pH值，發生多形性細胞轉變的規律，本研究對來自荷蘭菌保中心的8株A.pullulans標準菌株，以A.pullulans NG為對照進行了系統的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種出芽短梗霉(A.pullulans)NG，本實驗室分離鑒定;A.pullulans CBS147.97、CBS584.75、CBS100225、CBS110373、CBS249.65、CBS110374和CBS101160，荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)。

1.1.2 培養基①菌株保藏培養基(PDA):去皮土豆200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g;②YND培養基:每升含葡萄糖20.0 g，NaNO36.4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母浸出粉0.2 g，KH2PO41.0 g，pH 6.0;③YPD培養基:葡萄糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，酵母粉10.0 g，pH 6.0;④YAD培養基:葡萄糖20.0 g，(NH4)2SO45.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母浸出粉0.2 g，KH2PO41.0 g，pH 6.0;⑤磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液(pH 2.2～7.0)［7］。

1.1.3 主要試劑葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、瓊脂、NaNO3、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、C6H8O7·H2O等試劑均為分析純。

1.1.4 儀器SP-722E型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;SHA-C水浴恒溫振蕩器，國華;PHS-25型數字pH計，上海理達儀器廠;SCR20BC型低溫高速離心機，日立。

1.2 方法

1.2.1 細胞多形性種類和大小測定挑取PDA斜面上的保藏菌種，在固體YND平板上于25℃活化48 h，劃線法接種活化的菌種于pH 6.0的YAD固體平板，25℃培養11 d，每天觀察記錄菌落特征，初步分析菌株是否存在酵母狀細胞、膨大細胞、菌絲和厚垣孢子等多形性細胞。接種環挑取保藏菌種，接種于YND液體培養基，25℃180 r/min培養2 d，鏡檢觀察各菌株細胞多形性，并用顯微測微尺分別測定酵母狀細胞、膨大細胞和厚垣孢子大小。細胞大小以10個同種類型細胞的平均值表示:長軸μm×短軸μm。

1.2.2 各菌株生長pH值三基點菌種活化及培養條件同1.2.1，25℃180 r/min培養24 h取培養液1 mL測定菌液OD560nm，測定各菌株最高、最適和最低pH值，每個樣品3次重復。

1.2.3 pH值誘導細胞轉變接種環挑取保藏菌種，接種于YND液體培養基，25℃180 r/min培養2 d，作為一級液體種子。按5%接種量吸取一級種子液到YND液體培養基，25℃180 r/min培養，各菌種培養時間分別為NG培養7 h、CBS147.97培養5 h、CBS584.75培養8 h、CBS100225培養7 h、CBS110373培養6 h、CBS110374培養6 h、CBS249.65培養8 h、CBS101160培養8 h，使菌種形態盡量呈酵母狀，作為二級種子，測菌液OD560nm值。按10%接種量，吸取二級種子分別接種于pH為2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，25℃180 r/min培養36 h，隨機鏡檢計數100個細胞中酵母狀細胞、膨大細胞和厚垣孢子的個數，每個樣品3次重復。

2 結果與分析

2.1 出芽短梗霉不同菌株細胞多形性

出芽短梗霉的8個菌株均有典型的細胞多形性特征，具有酵母狀細胞、膨大細胞、厚垣孢子和菌絲(表1)。CBS來源的7株菌的酵母狀細胞短軸均在2.0 μm左右(1.89±0.27)～(2.41±0.25)μm，長軸伴隨細胞生長變化較大(3.75±0.37)～(5.05±0.71)μm。膨大細胞短軸在3.0 μm左右(2.85±0.26)～(3.80±0.24)μm，是酵母狀細胞短軸的約1.5倍(1.37～1.84)。與CBS來源的菌株比較，本實驗室保存菌株NG酵母狀細胞(短軸(3.76±0.71)μm)和膨大細胞(短軸(8.76±1.54)μm)個體較大，膨大細胞更典型，其短軸寬為酵母狀細胞短軸的2.33倍，便于分辨。因此，NG更適宜用于研究出芽短梗霉膨大細胞的細胞轉變和生理功能。膨大細胞的細胞壁加厚并積累黑色素轉變成厚垣孢子，個體比膨大細胞略大一點(表1)。圖1的a～d分別是CBS101160菌株的酵母狀細胞、膨大細胞、菌絲和厚垣孢子形態圖，其他菌株均具有這幾種基本形態。8株出芽短梗霉液體培養時，以細胞形態生長繁殖為主，生長后期才有少量菌絲發育。

表1 出芽短梗霉細胞多形性Table 1 Characteristics of various polymorphic cells of A.pullulans

圖1 出芽短梗霉多形性細胞(CBS101160)(40×)Fig.1 Polymorphism of A.pullulans(CBS101160)(40×)

2.2 逆境pH誘導膨大細胞轉變形成分生組織狀結構

分生組織狀結構(meristematic structure，MS)是黑酵母中某些屬，如Hortaea、Cladophialophora、Fonsecaea和Phialophora具有的一種特殊的細胞群體結構，常在低pH等逆境中形成［8］。本研究組前期結果表明，菌株NG在pH 1.5酸性培養基中可以形成分生組織狀結構［6］。經過鏡檢發現，8株出芽短梗霉在pH 2.2或pH 7.0的緩沖液中均可形成分生組織狀結構。這里以CBS 101160菌株為例，說明分生組織狀結構的形成過程。在培養初期，膨大細胞與出芽繁殖的后代不分離，3～6個細胞連在一起，形成“花瓣形”結構(圖2a)。膨大細胞聚集的數量越來越多，形成分生組織狀結構，在液體中呈白色絮狀沉淀(圖2b和2c)。pH 2.2或pH 7.0超出了菌體生長適宜酸堿度范圍，誘導了酵母狀細胞形態變化為分生組織狀結構。推測這種細胞組織方式更有利于抵抗逆境，但是具體機制還一無所知。

2.3 pH誘導細胞轉變

8株菌的最低生長pH均為3，最適pH值4或5，最高生長pH值在6或7(圖3)。在pH誘導細胞形態變化36 h時，絕大多數菌株的厚垣孢子還沒有形成，酵母狀細胞和膨大細胞為菌體的主要類型。在最適pH條件下(pH 4或5)，NG、CBS147.97、CBS584.75和CBS249.65的膨大細胞百分比達到50%，是主要細胞類型;而菌株CBS100225、CBS110373、CBS110374和CBS101160則以酵母狀細胞為主要細胞類型。

圖2 膨大細胞形成分生組織狀結構過程(CBS101160)(40×)Fig.2 The process of cell differentiation from SC into meristematic structure(MS)(CBS101160)(40×)

圖3 pH誘導多形性細胞轉變(膨大細胞百分率)Fig.3 pH induces polymorphism cell differentiation(Percentage of swollen cell)

在最低生長pH以下(pH 2.2)，除CBS 249.65和CBS584.75之外的6株菌膨大細胞的比例均顯著高于最適pH時的比例。酸性逆境條件可以誘導酵母狀細胞轉變成膨大細胞。在大于或等于最高生長pH條件下(pH 6或7)，CBS 147.97、CBS100225、CBS110374和CBS101160菌株的膨大細胞百分比達到另一個高點，顯著高于最適pH時的比例。說明50%的出芽短梗霉菌株酵母狀細胞轉變成膨大細胞也受高pH誘導。在pH 2.2～7.0范圍內，這些菌株的膨大細胞百分比隨著pH值的升高，表現為先降低再升高，呈U形曲線。

CBS249.65膨大細胞百分比隨pH變化呈現鐘罩型曲線，在最適pH時的比例最高。推測該菌株的膨大細胞是生長繁殖的主要細胞類型，不是適應不利酸堿環境的細胞類型。CBS584.75在各個pH環境中膨大細胞百分比均超過50%，細胞轉變受pH值影響較小。

供試的8株出芽短梗霉在pH 2.2或pH 7.0環境下均可形成分生組織狀結構，可以確定為這個屬的特性。多形性細胞轉變受pH值誘導這一表型，在不同菌株中表現出不同的敏感度。供試的8株出芽短梗霉菌中，多形性細胞轉變受pH值誘導的占75%，在不適宜生長的酸性條件下酵母狀細胞轉變為膨大細胞。其中有50%的菌株在高pH的條件下，也能啟動酵母狀細胞向膨大細胞的轉變。

2.4 出芽短梗霉生活史

根據研究結果，綜合8株出芽短梗霉細胞多形性轉變的共同特征，繪制出芽短梗霉生活史(圖4):1.酵母狀細胞(a)轉變成膨大細胞(b);2.膨大細胞(b)經過細胞壁增厚的過渡態(c)轉變成厚垣孢子(d);3.膨大細胞(b)萌發出芽管(i)轉變成菌絲體(l);4.膨大細胞(b)轉變成有隔膨大細胞(e)，經歷無隔膜的雙生膨大細胞(h);5.膨大細胞(b、e)轉變為分生組織狀結構(j)，k為初期的分生組織狀結構;6.分生組織狀結構(j)芽殖產生酵母狀細胞(a);7.有隔膨大細胞(e)經過細胞壁增厚的過渡態(f)轉變為有隔厚垣孢子(g);8.厚垣孢子(d、g)出芽轉變成菌絲體(l);9.厚垣孢子(d、g)芽殖產生酵母狀細胞(a);10菌絲體(l)轉變為念珠狀菌絲(m);11.菌絲體(l)芽殖(n)產生酵母狀細胞(a);12.念珠狀菌絲(m)芽殖產生酵母狀細胞(a);13.膨大細胞(b)芽殖產生酵母狀細胞(o)。

在出芽短梗霉生活史中，酵母狀細胞、膨大細胞和菌絲是生長繁殖的細胞類型;厚垣孢子和念珠狀菌絲是休眠體;分生組織狀結構抗性很強，有助于細胞度過逆境。在最適宜生長條件下，有一些菌株以酵母狀細胞為生長繁殖的主要類型(CBS100225、CBS110373、CBS110374和CBS101160)，還有一些則是以膨大細胞為主(NG、CBS147.97、CBS584.75和CBS249.65)。膨大細胞是細胞多形性轉變的中心環節，在不同的環境條件下可以轉變成菌絲、厚垣孢子或分生組織狀結構，還能夠出芽繁殖(圖4)。膨大細胞是一種穩定的細胞類型［6］，以往被認為僅僅是酵母狀細胞和厚垣孢子之間的過渡態，在出芽短梗霉生活史中的作用被顯著的低估了。

圖4 出芽短梗霉生活史Fig.4 Life cycle of A.pullulans

3 討論

出芽短梗霉細胞轉變特征表現出一定規律，菌株間也存在一定差異。在液體發酵過程中，不同的菌株的主要細胞類型可能是菌絲、酵母狀細胞或膨大細胞。現已發現，合成并分泌普魯蘭糖的是膨大細胞，不是菌絲和酵母狀細胞［6］。因此，在液體培養中以膨大細胞為主要生長繁殖類型的菌株NG、CBS147.97、CBS584.75和CBS249.65更適合發酵普魯蘭糖。菌株NG、CBS147.97、CBS249.65和CBS584.75的細胞轉變特征各不相同。隨著培養基pH上升，膨大細胞百分比分別呈現出逐漸降低、U形曲線、鐘罩型曲線和基本不受影響的不同規律。本研究組已經證明，在發酵過程中，可以通過控制pH值誘導NG酵母狀細胞轉變為合成普魯蘭糖的膨大細胞，提高普魯蘭糖合成水平。對于細胞轉變規律不同的菌株，是否可以采用控制pH值調節膨大細胞比例的方案發酵普魯蘭糖，將在后續的研究中驗證。

致謝:CBS147.97等7株A.pullulans受贈于荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)G.S.De Hoog教授，特此衷心感謝!

［1］ Penalva M A，Tilburn J，Bignell E，et al.Ambient pH gene regulation in fungi:making connections［J］.Trends Microbiol，2008，16(6):291-300.

［2］ Lamb T M，Mitchell A P.The Transcription Factor Rim101p Governs Ion Tolerance and Cell Differentiation by Direct Repression of the Regulatory Genes NRG1 and SMP1 in Saccharomyces cerevisiae［J］.Molecular and Cellular Biology，2003，23(2):677-686.

［3］ Ramos，S.G.A vegetative cycle of Pullularia pullulans［J］.Trans.Br.Mycol.Soc，1975，64:129-135.

［4］ David，G.P.and E.C.Richard.An analysis of Aureobasidium pullulans developmental stages by means of Scanning Electron Microscopy［J］.Mycologia，1977，69(4):783-792.

［5］ Gadd G M，Cooper L A.Strain and medium-related variability in the yeast-mycelial transition of Aureobasidium pullulans［J］.FEMS Microbiology Letters，1984，23(1):47-49.

［6］ Bing-xue Li，Ning Zhang，Qing Peng，et al.Production of pigment-free pullulan by swollen cell in Aureobasidium pullulans NG which cell differentiation was affected by pH and nutrition［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，84(2):293-300.

［7］ 陳鈞輝，陶力，朱婉華，等.生物化學實驗(第3版)［M］.北京:科學出版社，2003:245.

［8］ Zalar P，DE-Hoog GS.Gunde-Cimerman N.Trimmatostroma salinum，a new species from hypersaline water［J］.Studies in Mycology，1999，43:57-62.