Sigma B對單核細胞增生李斯特菌耐受抗生素作用的影響

王莉，馮飛飛，張強，馮曉琴，尹曉蛟，羅勤

(華中師范大學生命科學學院遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北武漢430079)

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特菌)，是人畜共患傳染病李斯特菌病(listeriosis)的主要病原菌［1］，能引起人和動物腦膜炎、敗血癥、流產等癥狀，是WHO公布的四大食源性致病菌之一［2］。臨床上主要用β-內酰胺類(盤尼西林青霉素，氨芐青霉素)抗生素來治療患者［3］。近20年來抗生素在臨床上的濫用，使病原細菌的耐藥性已成為嚴重的醫學問題，即使是一向被認為對抗生素敏感的單增李斯特菌，也表現出對不同種類和不同作用機理的抗生素，如青霉素、利福平、硫酸慶大霉素、四環素鹽酸和紅霉素等常用抗生素多重耐藥的趨勢［4］。但是，目前國內外關于該菌耐藥機制方面的研究較少，僅有的報道也集中于作用位點在單增李斯特菌細胞壁的抗生素，如盤尼西林青霉素和氨芐青霉素等作用的分子機理上［5］，而對其他抗生素的作用，迄今為止尚未見相關報道。Sigma B(σB)是許多革蘭陽性菌對環境脅迫產生應答反應的主要調控因子［6］。已有文獻顯示σB在枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌中，對多種抗生素產生耐藥性方面都具有重要的作用［7-8］，但在單增李斯特菌中σB是否也具有同樣功能，目前尚未見報道。本文通過比較單增李斯特菌標準菌株EGDe和其σB缺失株菌株EGDeΔsigB對盤尼西林青霉素、氨芐西林青霉素、利福平、硫酸慶大霉素、四環素鹽酸和紅霉素6種抗生素的最小抑菌濃度(MIC)以及檢測這2種菌株在1×MIC、2×MIC和8×MIC的氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平3種抗生素中的生長活性，研究σB在單增李斯特菌耐受抗生素中的作用，以期為深入研究革蘭陽性食源性致病菌的致病機理、預防和治療細菌感染提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株單核細胞增生李斯特菌標準菌株EGDe為德國維爾茨堡大學微生物系Werner Goebel教授饋贈;EGDeΔsigB為本實驗室構建保存。

1.1.2 試劑噻唑藍(MTT)(Sigma公司):溶解于PBS(pH 7.2)配制成5 mg/mL溶液，過濾除菌，4℃避光保存;SDS促溶劑:1.0 g SDS(Sigma公司)溶于50 mL蒸餾水中(加熱溶解)以無水乙醇補充至250 mL;抗生素溶解于雙蒸水或者無水酒精中配制成母液，過濾除菌，－20℃保存;盤尼西林青霉素、氨芐西林青霉素、利福平，均為Sigma公司產品;硫酸慶大霉素、四環素鹽酸、紅霉素均為Amresco公司產品;BHI培養基(Brain Heart Infusion)購自B＆D公司;二甲基亞砜為Promoter公司產品。其他化學試劑均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 EGDe和EGDeΔsigB MIC的測定參照藥品微生物學檢驗手冊［9］提供的方法進行:挑取待測菌株的單個菌落接種于BHI液體培養基中，37℃、150 r/min振蕩培養過夜，然后以1∶100的比例將菌液轉入新鮮的BHI培養基中繼續培養，待其OD600達到0.5時，將菌液加入到含有倍比稀釋的抗生素的培養基中，使其終濃度為105個/mL，繼續振蕩培養18 h。MIC的確定:以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細菌生長者，即為待測菌的MIC。

1.2.2 MTT比色法［10］檢測細菌的生長活性

MTT檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。在一定的濃度范圍內，甲瓚生成量與活細菌數目成線性相關，即甲瓚的濃度越高表示活細胞越多。甲瓚可用二甲亞砜及促溶劑溶解，并通過酶標儀測定其光吸收值，間接反映活細胞數量。本實驗分別挑取EGDe和EGDeΔsigB的單個菌落接種于BHI液體培養基中，37℃、150 r/min振蕩培養過夜，然后以1∶100的比例將菌液轉入新鮮的BHI培養基中繼續培養，待其OD600達到0.4時加入抗生素。以加入抗生素時記時為0，每隔固定時間，取菌液200 μL加40 μL MTT，37℃溫育30 min，5 000 r/min離心2 min，去上清，加100 μL二甲亞砜震蕩10 s后，加40 μL SDS促溶劑充分混勻，然后加1倍的95%乙醇混勻稀釋。測試液轉移到96孔板，每孔200 μL，酶標儀(美國BIO-TEK公司)測定570 nm波長的吸光值，采用Origin 5.0統計軟件繪制細菌的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 EGDe和EGDeΔsigB對6種抗生素的MIC

如表1所示，EGDe對盤尼西林青霉素、四環素鹽酸和硫酸慶大霉素的MIC高于EGDeΔsigB，2種菌株的MIC依次分別0.16和0.08 μg/mL，0.25和0.125 μg/mL，以及0.5和0.125 μg/mL;而對氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平的MIC 2種菌株沒有差別，分別為0.19、0.125和0.032 μg/mL。為了進一步研究σB在單增李斯特菌耐藥性中的作用，利用MTT法檢測比較了EGDe和EGDeΔsigB在后3種抗生素中的生長活性。

表1 EGDe和EGDeΔsigB對6種抗生素的MICTable 1 MICs of six antibiotics against EGDe and EGDeΔsigB

2.2 MTT法檢測EGDe和EGDeΔsigB在氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平3種抗生素中的生長活性

2.2.1 EGDe和EGDeΔsigB在氨芐西林青霉素中的生長活性如圖1所示，與未加抗生素的EGDe和EGDeΔsigB的生長相比，當加入氨芐西林青霉素后，EGDe和EGDeΔsigB的生長立即出現遲滯現象，活細胞量減少，生長曲線呈下降趨勢;經過一段時間的適應后，耐藥的細菌細胞恢復生長，曲線上升。EGDe和EGDeΔsigB遲滯程度以及解除遲滯、恢復生長所需的時間與加入的抗生素濃度均呈正相關。如1×MIC(0.19 μg/mL)的氨芐西林青霉素對EGDe的生長只有微弱的抑制作用，其生長曲線幾乎和未加抗生素時一致(圖1A);而2×MIC(0.38 μg/mL)的氨芐西林青霉素對EGDe的生長具有明顯的抑制作用(圖1B);當加入8×MIC(1.52 μg/mL)的氨芐西林青霉素時，其遲滯程度達到最大(圖1C)。與EGDe相比，EGDeΔsigB對加入的抗生素的作用更為敏感，當加入1×MIC(0.19 μg/mL)的氨芐西林青霉素時，其生長就出現較為明顯的遲滯，而且隨抗生素濃度升高，遲滯程度也比EGDe更為顯著，表明單增李斯特菌抵抗氨芐西林青霉素的抑制從而恢復生長的能力依賴于sigB基因。由此可見，sigB基因的編碼蛋白σB在單增李斯特菌耐受氨芐西林青霉素中具有重要作用。

圖1 MTT法比較EGDe和EGDeΔsigB在1×MIC(A)、2×MIC(B)和8×MIC(C)的氨芐西林青霉素中的生長活性Fig.1 Comparison of the growth activities of EGDe and EGDeΔsigB treated with 1×MIC(A)，2×MIC(B)and 8×MIC(C)of ampicillin，as well as untreated controls in the same diagram

2.2.2 EGDe和EGDeΔsigB在紅霉素中的生長活性圖2顯示的是EGDe和EGDeΔsigB在紅霉素中的生長曲線，其結果和這2種菌株在氨芐西林青霉素中的生長趨勢基本一致，即:當加入紅霉素后，EGDe和EGDeΔsigB的生長立即出現遲滯現象，而且遲滯程度以及解除遲滯、恢復生長所需的時間與加入的抗生素的濃度均呈正相關;同時，與EGDe相比，EGDeΔsigB對加入的抗生素的作用更為敏感，遲滯程度也比EGDe更為顯著。該結果表明單增李斯特菌抵抗紅霉素的抑制從而恢復生長的能力也依賴于sigB基因。σB在單增李斯特菌耐受紅霉素作用中具有重要作用。

圖2 MTT法比較EGDe和EGDeΔsigB在1×MIC(A)、2×MIC(B)和8×MIC(C)的紅霉素中的生長活性Fig.2 Comparison of the growth activities of EGDe and EGDeΔsigB treated with 1×MIC(A)，2×MIC(B)and 8×MIC(C)of erythromycin，as well as untreated controls in the same diagram

2.2.3 EGDe、EGDeΔsigB在利福平中的生長活性圖3顯示的是EGDe和EGDeΔsigB在利福平中的不同生長活性。與在氨芐西林青霉素(圖1)和紅霉素(圖2)中的生長曲線相比，盡管EGDe和EGDeΔsigB對利福平的作用均很敏感，1×MIC(0.032 μg/mL)的利福平就能顯著抑制2種菌株的生長活性(圖3A)，但同濃度的利福平作用下，EGDeΔsigB被抑制的程度比EGDe更深，解除遲滯時間、恢復生長所需的時間更長，顯示單增李斯特菌抵抗利福平的抑制從而恢復生長的能力依然依賴于sigB基因，表明σB在單增李斯特菌耐受利福平作用中具有重要作用。

圖3 MTT法比較EGDe和EGDeΔsigB在1×MIC(A)、2×MIC(B)和8×MIC(C)的利福平中的生長活性Fig.3 Comparison of the growth activities of EGDe and EGDeΔsigB treated with 1×MIC(A)，2×MIC(B)and 8×MIC(C)of rifampicin，as well as untreated controls in the same diagram

3 討論

近幾年的研究表明，食源性致病菌單增李斯特菌出現了耐藥性不斷增強的趨勢。自1988年首次報道了對四環素的1株耐藥株后，不斷從食品、環境、臨床等分離到多株耐受一或者多種抗生素的單增李斯特菌耐藥株［11-14］。而對于作為治療李斯特菌病的主要藥物—青霉素來說，其耐藥性更是明顯增強:2001年，Walsh等［13］首次報道了單增李斯特菌對青霉素(Penicillin G and Ampicillin)的耐藥率為0.6%(2例/351例);到2009年，Davis等［15］檢測了90株單增李斯特菌對苯唑青霉素(oxacillin)、頭孢曲松(ceftriaxone)和氯林肯青霉素(clindamycin)的耐藥率分別為99%、72%和21%。因此有必要對單增李斯特菌耐藥機理進行深入研究，為預防和治療細菌感染提供新的思路和理論依據。

Sigma B(σB)是許多革蘭陽性菌對環境脅迫產生應答反應的主要調控因子。研究表明σB因子在細菌產生耐藥性方面也具有重要的作用。將枯草芽胞桿菌sigB缺失突變株暴露在利福平中時，它的生長受到抑制，恢復生長的速度也沒有野生菌株快［7］。而對于金黃色葡萄球菌，σB更顯示出對多種抗生素產生抗性方面都具有重要的作用，如甲氧西林和萬古霉素［8，15］。本實驗通過檢測和比較單增李斯特菌野生菌株EGDe和其σB缺失突變菌株EGDeΔsigB對盤尼西林青霉素、氨芐西林青霉素、利福平、硫酸慶大霉素、四環素鹽酸和紅霉素6種抗生素的最小抑菌濃度(MIC)，以及在氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平中的生長活性的差異，探索σB與單增李斯特菌耐受抗生素作用的關系。本研究結果顯示:σB編碼基因sigB的缺失降低了突變株EGDeΔsigB對盤尼西林青霉素、硫酸慶大霉素和四環素鹽酸的MIC，以及在氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平中的生長活性，表明σB不僅僅參與耐受作用于單增李斯特菌細胞壁的抗生素，如盤尼西林青霉素和氨芐西林青霉素，同樣也參與調節作用于核糖體、RNA聚合酶、氨酰tRNA與核糖體的結合的抗生素的耐受應答，如紅霉素、硫酸慶大霉素、利福平和四環素鹽酸。因此，σB在單增李斯特菌耐受多種抗生素作用中均起著重要的作用。那么，σB的具體作用機理是怎樣的呢?目前沒有相關報道，根據已有的實驗證據推測:σB可能參與調控細菌體內與抗生素耐受性相關的基因的表達，從而直接或者間接作用于細菌耐藥性的產生。例如:Guinane等［16］發現單增李斯特菌細胞膜至少存在5種青霉素結合蛋白(PBP)，對這些蛋白進行插入失活后，相應突變株對盤尼西林青霉素(penicillin G)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢噻肟(cefotaxime)和頭孢呋辛(cefuroxime)4種β-內酰胺類的抗生素的MIC均有不同程度的降低。而這些青霉素結合蛋白的編碼基因如lmo0441，在Raengpradub等［17］的全基因組Microarry分析中被證明與σB調控相關。σB如何調節對其他抗生素的耐藥應答，需要進一步的研究。

另外，本實驗也表明在研究某個(些)基因在抗生素耐受性中的作用時，僅僅只檢測和比較標準株和突變株對抗生素的MIC，從而推斷目標基因的功能的話，可能會失去一些重要的信息。例如，在本試驗中，EGDe和其σB缺失突變菌株EGDeΔsigB對氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平的MIC一樣，但是通過檢測2種菌株在這3種抗生素中的生長活性，發現EGDeΔsigB對加入的抗生素更敏感，恢復生長所需時間更長，表明σB在細菌對抗生素產生應答并獲得耐藥性，解除遲滯過程中也起著重要的調節作用。

［1］ Farber JM，Peterkin PI.Listeria monocytogenes，a food-borne pathogen［J］.Microbiological Reviews，1991，55(3):476-511.

［2］ Rocourt J，BenEmbarek P，Toyofuku H，et al.Quantitative risk assessment of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods:the FAO/WHO approach［J］.FEMS Immunology＆Medical Microbiology，2003，35(3):263-267.

［3］ Hof H，Nichterlein T，Kretschmar M.Management of listeriosis［J］.Clinical Microbiology Reviews，1997，10(2):345-357.

［4］ 李迎惠，冉陸.李斯特菌的耐藥性及耐藥基因［J］.國外醫學:衛生學分冊，2004，31(2):120-124.

［5］ Begley M，Hill C，Ross RP.Tolerance of Listeria monocytogenes to cell envelope-acting antimicrobial agents is dependent on SigB［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72(3):2231-2234.

［6］ 馮瑩穎，張曉莉，羅勤，等.Sigma B因子活性的調節及其在幾種革蘭陽性食源性致病菌中的作用［J］.微生物學報，2008，48(6):839-843.

［7］Bandow JE，Brotz H，Hecker M.Bacillus subtilis tolerance of moderate concentrations of rifampin involves theσB-dependent general and multiple stress response［J］.Journal of Bacteriology，2002，184(2):459-467.

［8］ Singh VK，Schmidt JL，Jayaswal RK et al.Impact of sigB mutation on Staphylococcus aureus oxacillin and vancomycin resistance varies with parental background and method of assessment［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2003，21(3):256-261.

［9］ 馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊［M］.北京:科學出版社，2000:226-229.

［10］ 楊翠云，劉永定.MTT方法評價微生物細胞活性的探討［J］.水生生物學報，2009，33(4):577-580.

［11］ Poyart-Salmeron C，Carlier C，Trieu-Cuot P，et al.Transferable plasmid-mediated antibiotic resistance in Listeria monocytogenes［J］.Lancet，1990，335(8703):1422-1426.

［12］ Chen BY，Pyla R，Kim TJ，et al.Antibiotic resistance in Listeria species isolated from catfish fillets and processing environment［J］.Lletter in Applied Microbiology，2010，50(6):626-632.

［13］ Walsh D，Duffy G，Sheridan JJ，et al.Antibiotic resistance among Listeria，including Listeria monocytogenes，in retail foods［J］.Journal of Applied Microbiology，2001，90(4):517-522.

［14］ Davis JA，Jackson CR.Comparative antimicrobial susceptibility of Listeria monocytogenes，L.innocua，and L.welshimeri［J］.Microbial Drug Resistance，2009，15(1):27-32.

［15］ McAleese F，Wu SW，Sieradzki K，et al.Overexpression of genes of the cell wall stimulon in clinical isolates of Staphylococcus aureus exhibiting vancomycin-intermediate-S.aureus-type resistance to vancomycin［J］.Journal of Bacteriology，2006，188(3):1120-1133.

［16］ Guinane CM，Cotter PD，Ross RP，et al.Contribution of penicillin-binding protein homologs to antibiotic resistance，cell morphology，and virulence of Listeria monocytogenes EGDe［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2006，50(8):2824-2828.

［17］ Raengpradub S，Wiedmann M，Boor KJ.Comparative analysis of the σB-dependent stress responses in Listeria monocytogenes and Listeria innocua strains exposed to selected stress conditions［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74(1):158-171.