21種中草藥提取物對MRSA的抗菌作用研究

傅若秋，余 瓊，孟德勝，盧來春，張雪梅（.第三軍醫大學第三附屬醫院，重慶市40004；.西南大學園藝園林學院，重慶市 40075；3.重慶醫科大學醫學檢驗系，重慶市 40006）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是嚴重影響人類健康，導致壞死性肺炎、嚴重敗血癥、壞死性筋膜炎等疾病的重要致病菌[1]，如何防治已成為全球關注的焦點。萬古霉素是臨床上唯一確證對MRSA有效的藥物，但目前許多國家（包括中國）均發現了對萬古霉素耐藥的MRSA[2]。一旦MRSA發展到對萬古霉素普遍耐藥，MRSA感染患者將面臨無藥可治的危險境地，因此研究開發針對MRSA的新的抗菌藥物刻不容緩。天然植物特別是中草藥中蘊含著多種多樣的天然活性物質，從中篩選抗MRSA藥物是一個很好的途徑。筆者在對21種中草藥提取物進行篩選時發現其中8種具有抗MRSA作用，故對其進行了抗菌活性的初步研究。

1 材料

1.1 瓊脂平板與培養基

血瓊脂平板（CN）、M-H瓊脂平板（重慶龐通醫療器械有限公司）；Luria-Bertani培養基（LB，筆者配制，LB配方：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，pH7.2～7.4）。

1.2 藥敏紙片

萬古霉素、頭孢西丁、苯唑西林、頭孢呋辛、四環素、替考拉寧、氯霉素、利福平、紅霉素、頭孢唑啉、環丙沙星、左氧氟沙星、青霉素、慶大霉素、克林霉素藥敏紙片均購自英國Oxoid公司。

1.3 中草藥

蒲公英（Taraxaci Herba）、桑葉（Morus alba）、夏枯草（Prunella vulgaris）、半枝蓮（Scutellaria barbata）、木瓜（Chaenomeles sinensis）、仙鶴草（Agrimonia pilosa）、大血藤（Sargentodoxa cuneata）、側柏葉（Platycladus orientalis）、黃芪（Astragali Radix）、三七（Panax notoginseng）、白花蛇舌草（Oldenlandia diffusa）、淫羊藿（Epimedii Folium）、皂角刺（Gleditsia sinensis）、茵陳（Artemisiae Scopariae Herba）、陳皮（Citrus reticulata）、葛根（Pueraria lobata）、菊花（Chrysanthemum morifolium）、枇杷葉（Eriobotrya japonica）、大薊（Cirsium japonicum）、黨參（Codonopsis Radix）、紫蘇（Perilla frutescens）均由第三軍醫大學第三附屬醫院中草藥房提供，由筆者鑒定為真品。

1.4 菌種

MRSA臨床分離菌株（第三軍醫大學第三附屬醫院檢驗科惠贈）。

2 方法

2.1 水提物的制備

稱取每種中草藥各10 g，分別加100 mL純化水浸泡24 h，在電熱帽中加熱煎煮0.5 h，收集濾液，濾渣再加100 mL純化水加熱煎煮0.5 h，重復3次，合并濾液，過濾，濃縮至濃度為1 g·mL-1（以1 mL藥液含生藥量1 g計），滅菌后4℃貯藏，備用。臨用前取出，在無菌操作臺上用無菌純化水倍比稀釋至0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1，備用。

2.2 醇提物的制備

稱取每種中草藥各10 g，分別用95%乙醇150 mL浸泡7 d，共浸泡3次，過濾，合并濾液，回收乙醇，制成浸膏，用無菌純化水[含5%二甲基亞砜（DMSO）]配成濃度為1 g·mL-1（以1 mL藥液含生藥量1 g計）的藥液，滅菌后4℃貯藏，備用。臨用前取出，在無菌操作臺上用無菌純化水（含5%DMSO）倍比稀釋至0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1，備用。

2.3 菌液的制備

將菌種接種于含LB培養基的試管中，于37℃培養約24 h，用培養基調整其OD值為0.8，再用培養基稀釋1 000倍，相當于菌液濃度為105～106cfu·mL-1，備用。

2.4 抑菌試驗

2.4.1 MRSA耐藥性鑒定 采用K-B紙片擴散法測試MRSA對不同抗菌藥的敏感性。將菌液100μL均勻涂于M-H瓊脂平板上，待干后，分別貼上萬古霉素、頭孢西丁、苯唑西林、頭孢呋辛、四環素、替考拉寧、氯霉素、利福平、紅霉素、頭孢唑啉、環丙沙星、左氧氟沙星、青霉素、慶大霉素、克林霉素藥敏紙片，于37℃恒溫孵育24 h，測定抑菌環的大小，判斷其對藥物的敏感性。

2.4.2 初篩 于無菌96孔板中每孔加入菌液190μL和濃度為1 g·mL-1的中草藥提取物10μL，每種中草藥提取物重復3次；另取菌液190μL、無菌純化水10μL作為陽性菌對照；取培養基190μL、無菌純化水10μL作為陰性菌對照。于37℃培養24 h，肉眼觀察培養液澄清者，表明其對應的中草藥提取物有抑菌作用，用于后續試驗。

2.4.3 中草藥提取物抑菌/殺菌作用 于無菌96孔板中每孔加入菌液190 μL，分別加入濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1初篩有效的中草藥提取物10μL（相當于培養體系中提取物濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg·mL-1），每種中草藥提取物每個濃度重復3次；另取菌液190μL、無菌純化水10μL作為陽性菌對照；取培養基190μL、無菌純化水10μL作為陰性菌對照。于37℃培養24 h，肉眼觀察培養液澄清者表明所對應濃度的中草藥提取物有抑菌作用。將肉眼觀察到的澄清培養液取20μL轉種至血平板中，于37℃培養24 h后觀察結果，血平板中無細菌生長所對應濃度的中草藥提取物表明其有殺菌作用。計算不同濃度中草藥提取物對11株MRSA的抑菌率和殺菌率。

3 結果

3.1MRSA耐藥性鑒定

用頭孢西丁紙片擴散法來檢測金黃色葡萄球菌對苯唑西林的耐藥性，可作為臨床實驗室確證MRSA的一種簡便有效的方法[3]。采用NCCLS判斷標準[4]，11株MRSA均對苯唑西林、頭孢西丁、青霉素耐藥，符合MRSA的判斷標準；此外，11株MRSA對其他β-內酰胺類、頭孢菌素類、喹諾酮類、大環內酯類、氨基糖苷類等常見抗生素均不同程度耐藥，符合MRSA多重耐藥特征。11株MRSA對常見抗生素的耐藥情況分析見表1（S：敏感；M：中介；R：耐藥）。

表1 11株MRSA對常見抗生素的耐藥情況分析Tab 1 Drug resistance of 11 strains of SRSA against common antibiotics

3.2 初篩結果

21種中草藥中有8種對MRSA具有較強的抗菌活性，分別為半枝蓮、仙鶴草、蒲公英、夏枯草、桑葉、木瓜、側柏葉、大血藤。

3.3 抑菌/殺菌作用測定結果

3.3.1 抑菌作用測定結果 8種中草藥提取物均對11株MRSA具有抑菌作用，在50 mg·mL-1濃度下對11株MRSA的抑菌率均達到100%，但在1.563 mg·mL-1濃度下對MRSA均無抑菌作用（表中略去）。其中，半枝蓮水提物、仙鶴草醇提物的抑菌作用較強，在6.25 mg·mL-1濃度下對11株MRSA的抑菌率仍達100%，結果見表2。

表2 8種中草藥不同濃度提取物對11株MRSA的抑菌作用測定結果Tab 2 Antibacterial effects of 8 extracts of Chinese herbal medicine with different concentrations on 11 strains of MRSA

3.3.2 殺菌作用測定結果 8種中草藥提取物均對11株MRSA具有一定的殺菌作用，其中仙鶴草醇、水提物和半枝蓮、蒲公英、側柏葉的醇提物在50 mg·mL-1濃度下對11株MRSA的殺菌率可達100%；仙鶴草水提物在25 mg·mL-1濃度下對11株MRSA的殺菌率可達100%；但所有提取物在≤3.125 mg·mL-1濃度時對MRSA均無殺菌作用。其中，半枝蓮水提物與仙鶴草醇、水提物的殺菌作用較強，在6.25 mg·mL-1濃度下對11株MRSA的殺菌率分別為18.2%、45.5%、45.5%，結果見表3。

表3 8種中草藥不同濃度提取物對11株MRSA的殺菌作用測定結果Tab 3 Bactericidal effects of 8 extracts of Chinese herbal medicine with different concentrations on 11 strains of MRSA

4 討論

21種中草藥中，有8種中草藥的水提物和醇提物對MRSA均有抑制作用，其中仙鶴草醇、水提物和半枝蓮、蒲公英、側柏葉的醇提物具有較強的殺菌作用。

由試驗結果可見，同一中草藥的醇提物和水提物其抑菌作用可能差別很大，有的醇提物抑菌作用強于水提物，如木瓜同等濃度（12.5 mg·mL-1）醇提物抑菌率為90.9%，其水提物抑菌率為45.5%；而有的水提物作用強于醇提物，如蒲公英同等濃度下（6.25 mg·mL-1）水提物抑菌率為81.8%，其醇提物抑菌率僅為9.1%。而不同中草藥提取物間的抑菌作用差別就更大，如在3.125 mg·mL-1濃度下，半枝蓮醇提物和水提物的抑菌率分別達到36.4%和81.8%，而其他大多數中草藥提取物在此濃度下未表現出抑菌活性。

由于各中草藥提取物中所含組分、提取收率等均不盡相同，因此抗菌濃度大小的差異并不能完全真實反映各提取物所含活性成分之間的作用強度差異。盡管如此，筆者也能從抑菌率/殺菌率結果中判斷出該提取物是否有明顯的抗MRSA活性。

[1] Maree CL，Daum RS，BoyleVavra S，et al.Community-associated methicillin-resistant staphylococcus aureus isolates causing healthcare-associated infections[J].Emerg-ing Infect Dis，2007，13（2）：236.

[2] 謝紹華，王小華，許 鵬，等.耐萬古霉素MRSA重癥肺炎1例報告[J].江西醫藥，2010，45（3）：231.

[3] 諶秋華，范叢進.耐甲氧西林金葡菌的頭孢西丁檢測法與耐藥性分析[J].中國抗生素雜志，2005，30（11）：672.

[4] NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].Ninteen the Informational Supplement，2009，29（3）：47.