半夏生物堿對人肝癌細(xì)胞Bel-7402增殖的影響

陳 芳，楊 李，王曉昆，張 宜（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科，武漢市 430070）

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)之功效。臨床上可單獨或與其他藥物配伍用于治療食管癌、肝癌等。近年來研究半夏對肝癌的保護(hù)作用發(fā)現(xiàn)，其作用主要是通過殺傷癌細(xì)胞、抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機體免疫功能來實現(xiàn)的[1，2]。半夏生物堿是半夏的主要有效成分之一，為進(jìn)一步考察半夏生物堿抗肝癌的藥理活性，筆者對半夏生物堿影響人肝癌細(xì)胞株Bel-7402增殖的作用與機制進(jìn)行了初步研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CK2-TR型倒置顯微鏡、BX-51型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；RT2100C型酶標(biāo)儀（美國Rayto公司）；CA-1800型超凈工作臺（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）；5420型CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）。

1.2 試藥

半夏生物堿粉末（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科）；MTT（美國Amersco公司）；胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；細(xì)胞凋亡原位檢測（TUNEL）試劑盒、免疫組化SABC試劑盒、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病（Bcl-2）兔免疫球蛋白G（IgG）多抗、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）兔IgG單抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞系Bel-7402由武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供，以RPMI1640培養(yǎng)液于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 溶液的制備與細(xì)胞的培養(yǎng)

將40 mg半夏生物堿粉末溶于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基10 mL中，得終濃度為4 mg·mL-1的半夏生物堿貯備液，過濾后依次用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋為400、200、100μg·mL-1的應(yīng)用液，現(xiàn)配現(xiàn)用。MTT以PBS配成5 g·mL-1的濃度，經(jīng)抽濾后分裝入無菌微量離心管（EP規(guī)格：1 mL）中，封口，－20℃貯藏。胰蛋白酶以PBS配成0.25%的濃度，經(jīng)抽濾后分裝入無菌微量離心管（EP規(guī)格：1 mL）中，封口，－20℃貯藏。

將Bel-7402接種于含100 u·mL-1青霉素、100 u·mL-1鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基液中，細(xì)胞濃度為2×104個/mL，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞換液時間為2～3 d，3～5 d傳代，0.25%胰蛋白酶消化后以1∶2傳代。

2.2 細(xì)胞增殖測定

試驗分為5組，即空白對照、陰性對照和半夏生物堿高、中、低濃度組。采用MTT法，參考文獻(xiàn)[3]方法略加改進(jìn)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，將Bel-7402細(xì)胞以1×105個/mL濃度接種于96孔板，每孔100μL，24 h后更換培養(yǎng)液，半夏生物堿高、中、低濃度組分別加入400、200、100 μg·mL-1的半夏生物堿提取液，陰性對照組在細(xì)胞上加培養(yǎng)液，空白對照組只加培養(yǎng)液。每組設(shè)4個復(fù)孔，將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT 25μL，繼續(xù)孵育4 h形成甲結(jié)晶，小心吸棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）125μL/孔，微量震蕩器震蕩5 min后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上于490 nm波長處測定吸光度（OD）值，按下列公式計算細(xì)胞生長抑制率（重復(fù)3次）：抑制率（%）＝（陰性對照組OD值－用藥組OD值）（/陰性對照組OD值－空白對照組OD值）。

2.3 TUNEL技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

試驗分為4組，即陰性對照和半夏生物堿高、中、低濃度組。24孔培養(yǎng)板每孔置入一塊無菌玻片。取對數(shù)生長期Bel-7402細(xì)胞消化制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，接種于24孔板內(nèi)，1 mL/孔。置培養(yǎng)箱24 h后，半夏生物堿高、中、低濃度組加入半夏生物堿，終濃度分別為400、200、100μg·mL-1，陰性對照組在細(xì)胞上加培養(yǎng)液。以上各組均平行6孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出爬滿細(xì)胞的玻片，PBS漂洗2遍，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌后自然風(fēng)干，－20℃貯藏。

取上述細(xì)胞爬片，以滲透液（0.1%TritonX-100+0.1%枸櫞酸鈉）浸潤于冰上，反應(yīng)2 min后滴加50μL新鮮配置的TUNEL混合反應(yīng)液（含45μL TdT反應(yīng)緩沖液、5μL熒光素標(biāo)記的dUTP），37℃水浴共孵60 min。以上各步驟間均以PBS（pH7.4）沖洗3次。中性樹膠封片。對照試驗：以50μL標(biāo)記液代替TUNEL混合反應(yīng)液作陰性對照；陽性對照玻片經(jīng)DNaseI緩沖液預(yù)處理10 min后，按TUNEL染色步驟進(jìn)行。

熒光顯微鏡下在450～500 nm波長范圍激發(fā)熒光，以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)較強熒光者計為TUNEL陽性細(xì)胞。每張玻片隨機觀察10個高倍視野（400×），計數(shù)陽性細(xì)胞占全部癌細(xì)胞的比例作為凋亡率（%）。

2.4 SABC染色法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

試驗分為5組，即陰性對照、陽性對照和半夏生物堿高、中、低濃度組。半夏生物堿高、中、低濃度組加入半夏生物堿，終濃度分別為400、200、100 μg·mL-1。取“2.3”項下細(xì)胞爬片作下列處理：（1）純丙酮室溫固定15 min，蒸餾水沖洗2次；（2）純甲醇加H2O2至0.5%，室溫浸泡30 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗3次；（3）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min后甩去多余液體；（4）分別滴加Bax單抗與Bcl-2多抗，37℃保持40 min；（5）滴加生物素化羊抗鼠IgG，37℃保持20 min，以0.1 mol·L-1PBS洗2 min×3次；（6）滴加SABC，37 ℃保持20 min，以0.1 mol·L-1PBS洗5 min×4次；（7）DAB顯色，蒸餾水洗滌；（8）蘇木素輕度復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替Bax單抗和Bcl-2多抗作陰性對照；用已知乳腺癌陽性切片作為陽性對照。

結(jié)果判斷以胞漿和（或）胞膜被染成棕褐色判為Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞。顯微鏡下每張切片隨機選5個高倍視野（400×），不少于500個腫瘤細(xì)胞，計數(shù)陽性細(xì)胞占全部腫瘤細(xì)胞的比例作為Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞率。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

試驗數(shù)據(jù)以x±s 表示，采用方差分析，利用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 半夏生物堿對Bel-7402細(xì)胞增殖的影響

作用24 h后，高、中、低濃度半夏生物堿（400、200、100 μg·mL-1）對Bel-7402細(xì)胞增殖均有顯著抑制作用，其抑制作用隨藥物濃度增高而有加強趨勢，最高抑制率可達(dá)36.98%，且呈量效關(guān)系。半夏生物堿對Bel-7402細(xì)胞增殖的影響見表1（空白對照組略去）。

3.2 半夏生物堿對Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞核呈較強熒光，部分細(xì)胞核破裂，呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片，或呈梅花狀細(xì)胞核。半夏生物堿高、中、低濃度組均能有效誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡，且呈顯著的量效關(guān)系。半夏生物堿對Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響見表2。

表1 半夏生物堿對Bel-7402細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab 1 Effects of alkaloids of P.ternata on Bel-7402 cell proliferatio（n±s）

表1 半夏生物堿對Bel-7402細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab 1 Effects of alkaloids of P.ternata on Bel-7402 cell proliferatio（n±s）

與陰性對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.negative control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別陰性對照組半夏生物堿高濃度組半夏生物堿中濃度組半夏生物堿低濃度組-36.98 15.20 12.97-400 200 100 4 4 4 4 0.78±0.02 0.49±0.07＊＊0.66±0.04＊0.68±0.05＊細(xì)胞增殖抑制率/%濃度/μg·mL-1n OD值

表2 半夏生物堿對Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響（±s）Tab 2 Effects of alkaloids of P.ternata on apoptosis rate of Bel-7402 ce（ll±s）

表2 半夏生物堿對Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響（±s）Tab 2 Effects of alkaloids of P.ternata on apoptosis rate of Bel-7402 ce（ll±s）

與陰性對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.negative control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別陰性對照組半夏生物堿高濃度組半夏生物堿中濃度組半夏生物堿低濃度組凋亡率/%3.22±1.65 12.45±1.13＊＊7.54±1.00＊6.40±1.49＊濃度/μg·mL-1-400 200 100 n 6 6 6 6

3.3 半夏生物堿對Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

Bcl-2、Bax蛋白主要定位于細(xì)胞漿，亦可見于胞膜，染色陽性信號呈棕褐色。半夏生物堿高、中、低濃度組Bcl-2、Bax表達(dá)顯色與陰性對照組比較，有顯著性差異（P＜0.01或P＜0.05）。半夏生物堿對Bax、Bcl-2表達(dá)的影響見表3（陽性對照組略去）。

表3 半夏生物堿對Bax、Bcl-2表達(dá)的影響（±s）Tab 3 Effect of alkaloids of P.ternata on Bax and Bcl-2 protein expression（±s）

表3 半夏生物堿對Bax、Bcl-2表達(dá)的影響（±s）Tab 3 Effect of alkaloids of P.ternata on Bax and Bcl-2 protein expression（±s）

與陰性對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.negative control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別陰性對照組半夏生物堿高濃度組半夏生物堿中濃度組半夏生物堿低濃度組35.16±1.24 31.48±1.13＊27.86±3.35＊26.72±1.26＊＊-400 200 100 6 6 6 6 24.51±1.16 26.55±0.42＊28.70±0.93＊33.12±0.32＊＊Bcl-2陽性細(xì)胞率/%濃度/μg·mL-1n Bax陽性細(xì)胞率/%

4 討論

肝癌的發(fā)病率較高，其治療仍是臨床亟待解決的問題。從植物中篩選有效的活性物質(zhì)治療肝癌是目前中藥發(fā)展方向之一。近年來，相關(guān)研究表明半夏具有確切的抗癌作用，對食道癌、胃癌、上頜癌、舌癌、皮膚癌、惡性淋巴癌有一定療效[4，5]。體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞試驗也表明，半夏提取物對動物試驗性腫瘤S180、宮頸癌-14、肝癌、子宮頸癌Hela細(xì)胞、JTC-26細(xì)胞等體外試驗均具有一定抑制作用[6，7]。本文中，筆者通過MTT法、TUNEL技術(shù)和SABC方法來進(jìn)一步研究半夏生物堿對肝癌細(xì)胞Bel-7402的抑制作用。

文獻(xiàn)報道，半夏提取物對肝癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞等生長具有抑制作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)400、200、100 μg·mL-1濃度的半夏生物堿對Bel-7402有明顯的抑制作用，抑制率與陰性對照組比較有顯著性差異，且隨著半夏生物堿濃度的增加，抑制作用逐漸增強；TUNEL染色法發(fā)現(xiàn)半夏生物堿高、中、低濃度組均能有效誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡，呈顯著的量效關(guān)系，提示半夏生物堿對Bel-7402的抑制作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡這一途徑產(chǎn)生的。

細(xì)胞凋亡是受多種基因調(diào)控的主動過程，其中Bax和Bcl-2發(fā)揮了重要作用[9]。Bcl-2與Bax位于線粒體、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，兩基因有40%的同源性。Bcl-2是哺乳動物細(xì)胞凋亡最重要的調(diào)控基因之一，在細(xì)胞凋亡過程中處于調(diào)控機制的終末部分，對維持細(xì)胞生理性分化發(fā)育和細(xì)胞數(shù)量的動態(tài)平衡，以及在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因家族中至少15個成員，促凋亡成員包括促凋亡基因Bax、Bcl-xs、Bad、Bak、Bik、Bid等，抗凋亡成員包括抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Al、MCL-l等。Bax 、Bcl-2可彼此形成異源二聚體或與自身形成同源二聚體，其抑制或促進(jìn)凋亡主要取決于兩者的比例[10，11]。近年來研究提示，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡不僅取決于自身的表達(dá)高低，而且還與Bcl-2/Bax的比值有關(guān)。Bcl-2/Bax是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，其比值增加則抑制細(xì)胞凋亡，反之則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果表明，400、200、100μg·mL-1濃度的半夏生物堿對肝癌細(xì)胞Bel-7402的Bax、Bcl-2表達(dá)顯色與陰性對照組比較，Bcl-2表達(dá)下降而Bax表達(dá)升高，其Bax、Bcl-2基因表達(dá)水平有顯著性的差異，提示半夏生物堿誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡作用可能是通過調(diào)控凋亡基因Bax、Bcl-2表達(dá)來實現(xiàn)的，但關(guān)于其中更深入的作用機制尚需進(jìn)一步研究。

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