姜黃素對長期攝入酒精和不同量蛋白質的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的保護作用研究Δ

周旭春（重慶醫科大學附屬第一醫院消化內科，重慶市 400016）

筆者前期研究發現，過高或過低蛋白質攝入都將促進腺泡細胞結構的破壞，加速酒精性胰腺損傷的進程[1]。姜黃素（Curcumin）是從姜黃中提取的一種多酚類色素，有廣泛的藥理作用。其在抗炎、腫瘤預防和治療上近年都備受關注[2]。已有研究發現，姜黃素對急性胰腺炎胰腺腺泡細胞的損傷有保護作用[3]，但其對酒精聯合過高、過低蛋白質攝入造成的胰腺損傷的作用如何尚未見文獻報道。為此，筆者對其進行研討，以期為姜黃素的臨床應用提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CKX41型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；5810R型高速低溫離心機（德國Eppendorf公司）；M2e型多功能酶標儀（重慶邁克科技公司）；AUW120D型電子天平（日本島津公司）；600型電子顯微鏡（日本Hitach公司）。

1.2 試藥

姜黃素（生工生物工程（上海）有限公司）；環氧化酶-2（COX-2）羊單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；TUNEL試劑盒（美國Roche公司）；淀粉酶檢測試劑盒（上海科華-東菱診斷用品有限公司）；脂肪酶檢測試劑盒（德國GmbH公司）。

1.3 動物

清潔級Wistar大鼠30只，♂，體重80～110 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供（動物生產許可證號：SCXK（渝）20070001）。

2 方法

2.1 復制模型

Wistar大鼠總熱量供給相同，脂肪含量占總熱量供給的25%，隨機分組如下：正常對照組，正常飼養；酒精組，以25%酒精代替飲水自由飲用，其中又隨機分為高蛋白（蛋白質占總熱量供給的32%）、高蛋白+姜黃素（蛋白質占總熱量供給的32%，ig姜黃素300 mg·kg-1）、低蛋白（蛋白質占總熱量供給的6%）、低蛋白+姜黃素（蛋白質占總熱量供給的6%，姜黃素300 mg·kg-1）組。

各組大鼠其他礦物質和微量元素攝入相當，每組6只，分別喂給上述特種飼料6個月，實驗結束時處死大鼠，稱重，取出胰腺組織。

2.2 光鏡下觀察胰腺組織形態學變化

取少量胰腺組織固定于10%中性甲醛緩沖液中，HE染色，由專業病理醫師觀察切片。

2.3 電鏡下觀察胰腺腺泡細胞超微結構

切取火柴頭大小的胰腺組織，2.5%戊二醛固定，制片后于電鏡下觀察胰腺腺泡細胞超微結構的改變。

2.4 胰腺外分泌功能檢測

取部分胰腺組織制成組織勻漿，以3 000 r·min-1離心，取上清液，分別檢測每1 mL胰腺組織勻漿中的淀粉酶和脂肪酶含量。

2.5 大鼠胰腺組織細胞凋亡檢測（TUNEL法）

取胰腺組織制成的石蠟切片，二甲苯脫蠟，微波爐修復抗原，蛋白酶K作用30 min，其余步驟按試劑盒說明書進行。最后在光鏡下觀察，細胞核染色呈棕黃色，為凋亡細胞。凋亡指數（AI）計算方法：在高倍視野（400×）下，選擇5個視野分別計數200個細胞，分別計數凋亡細胞和總細胞數（AI＝凋亡細胞數/總細胞數×100%）。

2.6 胰腺組織切片COX-2表達的檢測

取胰腺組織制成的石蠟切片，二甲苯脫蠟，微波爐修復抗原，0.3%H2O230 min去除內過氧化酶，PBS洗滌，正常血清室溫封閉30 min，分別滴加工作濃度為1∶100的羊抗50 μL，細胞漿染成棕黃色為COX-2表達陽性。結果以圖像分析儀作積分光密度量化處理。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 體重的稱定

高蛋白、高蛋白+姜黃素、低蛋白、低蛋白+姜黃素、正常對照組大鼠體重分別為（260±25）、（275±30）、（250±23）、（263.5±19）、（253.5±15.0）g，各組間比較無顯著性差異。

3.2 病理形態學的改變

3.2.1 腺泡細胞顯微結構的改變 HE染色顯示，高、低蛋白組胰腺腺泡細胞內可見脂肪空泡，腺泡細胞充血水腫；2組在加用姜黃素后，腺泡細胞充血水腫有所減輕。但各組胰腺組織顯微結構無顯著性差異，故圖片略去。

3.2.2 腺泡細胞超微結構的改變 各組大鼠胰腺腺泡細胞均有不同程度的損傷。高蛋白組大鼠的胰腺腺泡細胞線粒體普遍腫脹，體積增大，基質內出現多個亮區，基質顆粒減少，嵴少，細胞內脂滴增加，酶原顆粒減少，髓樣結構形成。高蛋白+姜黃素組腺泡細胞內腫脹線粒體數量減少，酶原顆粒增加，髓樣結構減少。進食高蛋白飼料的所有大鼠胰腺腺泡細胞粗面內質網均無明顯改變。低蛋白組線粒體腫脹，粗面內質網擴張，可見髓樣結構形成，部分細胞溶解壞死。低蛋白+姜黃素組線粒體腫脹減輕，髓樣結構減少，未見細胞溶解壞死。胰腺腺泡細胞超微結構的改變見圖1。

3.3 胰腺外分泌功能的改變

圖1 胰腺腺泡細胞超微結構的改變（6 000×）A.高蛋白組；B.高蛋白+姜黃素組；C.低蛋白組；D.低蛋白+姜黃素組Fig 1Ultra-microstructure of pancreatic acinar cel（l6 000×）A.high protein group；B.high protein+curcumin group；C.low protein group；D.low protein+curcumin group

無論攝入高蛋白、低蛋白飼料，加用姜黃素后，胰腺組織勻漿淀粉酶、脂肪酶含量均較未用姜黃素時有所增加，其中高蛋白+姜黃素組胰腺組織勻漿淀粉酶和脂肪酶較高蛋白組顯著增加（P＜0.05），低蛋白+姜黃素組脂肪酶較低蛋白組顯著增加（P＜0.05）。大鼠胰腺組織勻漿淀粉酶、脂肪酶的改變見表1。

表1 大鼠胰腺組織勻漿淀粉酶、脂肪酶的改變（±s）Tab 1 Changes of lipase and amylase in pancreatic tissue homogenat（e±s）

表1 大鼠胰腺組織勻漿淀粉酶、脂肪酶的改變（±s）Tab 1 Changes of lipase and amylase in pancreatic tissue homogenat（e±s）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與高蛋白組比較：#P＜0.05；與低蛋白組比較：△P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.high protein group：#P＜0.05；vs.low protein group：△P＜0.05

脂肪酶/U·g-1 10 193.06±206.27 263.16±15.22＊798.43±28.68#111.67±8.87＊163.89±9.90△分組正常對照組高蛋白組高蛋白+姜黃素組低蛋白組低蛋白+姜黃素組淀粉酶/U·g-1 6 532.87±100.11 364.49±15.09＊423.31±20.66#91.67±6.53＊103.42±10.32△

3.4 細胞凋亡檢測結果

與正常對照組比較，高、低蛋白組AI均顯著升高（P＜0.01）；與高蛋白組比較，高蛋白+姜黃素組AI顯著降低（P＜0.05）；與低蛋白組比較，低蛋白+姜黃素組AI顯著降低（P＜0.05）。細胞凋亡檢測結果見表2。

3.5 COX-2檢測結果

經圖像分析檢測得高蛋白組、高蛋白+姜黃素組、低蛋白組、低蛋白+姜黃素組光密度值分別為（0.13±0.03）、（0.08±0.02）、（0.22±0.03）、（0.14±0.06），表明加用姜黃素后，高、低蛋白組大鼠胰腺腺泡細胞胞漿COX-2的棕黃染色均變淺。胰腺腺泡細胞COX-2的表達見圖2。

4 討論

表2 細胞凋亡檢測結果（±s）Tab 2 Results of detection of cell apoptosi（s±s）

表2 細胞凋亡檢測結果（±s）Tab 2 Results of detection of cell apoptosi（s±s）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與高蛋白組比較：#P＜0.05；與低蛋白組比較：△P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.high protein group：#P＜0.05；vs.low protein group：△P＜0.05

分組正常對照組高蛋白組高蛋白+姜黃素組低蛋白組低蛋白+姜黃素組AI/%0.31±0.1 2.1±0.1＊1.5±0.3#6.6±1.0＊4.3±0.5△

圖2 胰腺腺泡細胞COX-2的表達（200×）A.高蛋白組；B.高蛋白+姜黃素組；C.低蛋白組；D.低蛋白+姜黃素組Fig 2 Expression of COX-2 in pancreatic acinar cell（200×）A.high protein group；B.high protein+curcumin group；C.low protein group；D.low protein+curcumin group

慢性胰腺炎是以胰腺實質發生慢性持續性炎性損害、纖維化和可能導致的胰管擴張、胰管結石或鈣化等不可逆性的形態改變為其特征，可引起頑固性疼痛和永久性內、外分泌功能丟失[4]的炎癥疾病。流行病學調查顯示，酒精是慢性胰腺炎最主要的病因。但前人動物實驗研究發現，長期飲酒并未造成典型的慢性胰腺炎的病理改變。筆者前期研究發現，長期飲酒僅造成大鼠胰腺的外分泌功能減退，但胰腺的顯微結構卻無顯著性改變，胰腺腺泡細胞的超微結構可見髓樣結構形成，呈慢性胰腺腺泡細胞退行性改變[5]。有研究認為，慢性胰腺腺泡細胞退行性改變可能是酒精性慢性胰腺腺泡細胞損傷的早期改變。

本研究中，給大鼠喂飼姜黃素后，大鼠胰腺腺泡細胞的顯微結構雖無特別的變化，但無論高蛋白組還是低蛋白組其超微結構均發生了不同程度的改變，表現為線粒體腫脹減輕，髓樣結構減少，胰腺腺泡細胞的凋亡減少，胰腺組織的淀粉酶和脂肪酶的含量均較正常對照組有不同程度的升高，提示使用姜黃素后胰腺腺泡細胞的退行性改變有改善。

姜黃素是一種多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化等廣泛的藥理活性，且毒性低、不良反應小。近年研究發現，姜黃素具有某些非甾體類抗炎藥物的特性，可抑制COX-2的表達。COX-2是調節花生四烯酸轉化為前列腺素的限速酶，是炎癥性損傷的一個標志物[6，7]。筆者前期研究已發現酒精性胰腺損傷時COX-2的表達增加，其表達與胰腺腺泡細胞的損傷程度有關，胰腺腺泡細胞的損傷越輕，COX-2的表達越低[7]。慢性炎癥時COX-2的表達增加，抑癌基因失活，COX-2的表達與胰腺癌的發生有關[8]。本研究中姜黃素對高、低蛋白組COX-2的表達均有不同程度的抑制。因此，筆者推測姜黃素可能通過抑制COX-2的表達，來減少胰腺腺泡細胞凋亡，改善胰腺腺泡細胞退行性改變。

總之，本研究觀察了姜黃素對過高、過低蛋白質聯合慢性酒精攝入所致的胰腺腺泡細胞退行性病變的影響，發現姜黃素可減輕胰腺腺泡細胞的退行性改變，此作用可能與抑制COX-2的表達有關。由于COX-2的表達與胰腺腺泡細胞的損傷和胰腺癌的發生有關，因此在酒精致胰腺腺泡細胞退行性改變、慢性胰腺炎的過程中，間歇使用姜黃素，對這一漫長過程的各個階段可能均有修復和減緩發展的作用，有利于預防和治療慢性胰腺炎、胰腺癌。

[1] 周旭春，唐承薇，劉純倫.蛋白質攝入量在酒精性胰腺損傷中的作用[J].胰腺病學，2006，6（2）：69.

[2] Julie SJ.Anti-inflammatory properties of curcumin，a major constituent of curcuma longa：a review of preclinical and clinical research[J].Alternative Medicine Review，2009，14（2）：141.

[3] Gulcubuk A，Altunatmaz K，Sonmez K，et al.Effects of curcumin on tumour necrosis factor-alpha and interleukin-6 in the late phase of experimental acute pancreatitis[J].J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med，2006，53（1）：49.

[4] 中華醫學會外科學分會胰腺外科學組.慢性胰腺炎診治指南（討論稿）[J].中國實用外科雜志，2009，29（1）：1.

[5] 周旭春，唐承薇，劉純倫.長期乙醇攝入導致胰腺腺泡細胞退行性改變[J].中華消化雜志，2005，25（5）：284.

[6] Ozhan G，Yanar TH，Ertekin C，et al.The effect of genetic polymorphisms of cyclooxygenase 2 on acute pancreatitis in Turkey[J].Pancreas，2010，39（3）：371.

[7] O'Brien G，Shields CJ，Winter DC，et al.Cyclooxygenase-2 plays a central role in the genesis of pancreatitis and associated lung injury[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2005，4（1）：126.

[8] Song Z，Bhagat G，Quante M，et al.Potential carcinogenic effects of cigarette smoke and Swedish moist snuff on pancreas：a study using a transgenic mouse model of chronic pancreatitis[J].Lab Invest，2010，90（3）：426.